劉佳寧，馬銀鵬，王玉文，張介馳，張丕奇

（黑龍江省科學(xué)院微生物研究所，哈爾濱 150010）

木耳（Auricularia auricular judae）別名黑木耳、光木耳，真菌學(xué)分類屬擔(dān)子菌綱、木耳目、木耳科。其擔(dān)子果膠質(zhì)，圓盤形或耳形，新鮮時軟，干后收縮，色澤黑褐，質(zhì)地柔軟，味道鮮美，營養(yǎng)豐富，是強(qiáng)身健體的理想食品。它還具有很高的藥用價值，是世界公認(rèn)的高營養(yǎng)保健食品［1］。我國的栽培規(guī)模逐年擴(kuò)大，木耳產(chǎn)業(yè)已經(jīng)成為東北部分地區(qū)的主導(dǎo)產(chǎn)業(yè)，在農(nóng)業(yè)總產(chǎn)值中占有較大比重。

近年來，東北地區(qū)特別是黑龍江東寧、尚志、伊春和吉林蛟河等地區(qū)的栽培面積不斷擴(kuò)大，部分地域由一年一季生產(chǎn)變?yōu)榇呵飪杉旧a(chǎn)。但由于栽培環(huán)境的惡化，連年重復(fù)生產(chǎn)的老耳房，環(huán)境滅菌的次數(shù)和間隔時間達(dá)不到要求，造成在高溫、陰暗、潮濕、通風(fēng)不良、衛(wèi)生條件差的環(huán)境條件下大量生產(chǎn)，極易發(fā)生雜菌侵染性病害，致使木耳減產(chǎn)，嚴(yán)重影響收益。

近期在以上地區(qū)就發(fā)生了一種高危侵染性病害，其發(fā)病特點(diǎn)為病原菌生長迅速，在接菌后7～10d，長覆蓋菌袋表面，整個菌袋表面迅速變?yōu)楹谏?在菌袋與培養(yǎng)基中間形成一層致密的黑色菌絲覆蓋層,并伴有大量黑色的凸起產(chǎn)生。該病具有發(fā)病快、傳播廣的特點(diǎn)。生產(chǎn)第一線種植戶將這種病害稱之為“黑木耳黑皮病”。目前，關(guān)于該病害病原菌的分類地位、危害狀況、遺傳分化狀況等情況均未見報道，更缺乏對該病害的防治方法。為防止該病害蔓延，減少農(nóng)民收益損失，迫切需要對該病害進(jìn)行深入而系統(tǒng)地研究，夯實(shí)基礎(chǔ)，為研發(fā)出適合的綜合防治方法提供依據(jù)。

從4個木耳主產(chǎn)區(qū)采集多個病原樣品，根據(jù)科赫法則的基本步驟進(jìn)行了一系列分離培養(yǎng)、病原菌回接等試驗(yàn)，確定病原菌為一種黑色腐生真菌，并且通過形態(tài)觀察比對，確定了該病原菌的分類地位，利用I TS序列分析，進(jìn)一步對該菌株進(jìn)行鑒定及遺傳多樣性分析。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

試驗(yàn)所用病原菌菌種由病原地采集獲得。對照試驗(yàn)所用木耳菌種為“黑29”，由黑龍江省科學(xué)院微生物研究所提供。I TS序列擴(kuò)增所用引物為I TS1-F：5′-CTT GGTCATTTAGAGGAAGTAA-3′和ITS4-B∶

5′-CAGGAGACTTGTACACGGTCCAG-3′，引物由大連寶生物有限公司合成。試驗(yàn)用培養(yǎng)基配方為：第一，改良PDA培養(yǎng)基，配方為：水1000m L、馬鈴薯200g、葡萄糖 20g、瓊脂 20g、磷酸二氫鉀 3g、硫酸鎂1.5g。第二，改良P D液體培養(yǎng)基，配方為：水1000m L、磷酸二氫鉀3g、硫酸鎂1.5g、馬鈴薯200g、葡萄糖20g。第三，三級種配方為：木屑78%、麥麩20%、石膏1%、石灰1%。

1.2 方法

1.2.1 病害調(diào)查與病原菌菌株獲取

采集具有典型病害特征的樣品(見圖1)進(jìn)行分離培養(yǎng)，獲取純病原菌菌株。該病典型發(fā)病特征為：初期菌絲潔白生長迅速，7～10d，長滿袋（袋規(guī)格為16cm×33cm）。長滿袋后7～10 d菌袋變?yōu)楹谏诰c培養(yǎng)基之間形成大量黑色凸起。大約20～24d左右，在黑色凸起處產(chǎn)生黃色絲狀物質(zhì)并隨風(fēng)傳播。菌袋內(nèi)黑木耳菌絲由于沒有足夠生長空間，造成產(chǎn)量劇減甚至絕產(chǎn)。將分離出的病原菌暫時定名為未知真菌unknownfungi，以便于后期應(yīng)用分子生物學(xué)方法進(jìn)行數(shù)據(jù)分析使用。4d，用挑取適量菌絲在顯微鏡下觀察照相并測量。用刀片切取真子座型載孢體截面觀察結(jié)構(gòu)和其內(nèi)部的分生孢子形態(tài)。

圖1 黑木耳“黑皮病”病害樣品圖Fig.1 Sample of black skin of Auricularia auricular

1.2.4 菌絲體培養(yǎng)及DNA提取

將病原菌菌種接種于液體P D培養(yǎng)基中，25℃培養(yǎng)3～5 d，收集菌絲，濾紙吸干后冷凍保存。采用CTAB法提取DNA，DNA提取物于-20℃冰箱貯藏備用。

1.2.5 I TS序列提取、對比與分析

對未知真菌unknownfungi進(jìn)行ITS序列的擴(kuò)增。引物為PCR反應(yīng)在Gene Amp PCRSystem 9700 PCR儀上進(jìn)行擴(kuò)增，20μL的反應(yīng)體系內(nèi)各種成分反應(yīng)濃度（見表1）。擴(kuò)增程序?yàn)椋?4℃預(yù)變性5min，94℃變性 30s，56 ℃退火 45 s，72 ℃延伸 2min，30 個循環(huán)，最后在72℃延伸10min，每次反應(yīng)均設(shè)置一個空白對照，以去離子水代替模板，以排除系統(tǒng)誤差。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物用1.0%的瓊脂糖（含0.5μg/m LEB）電泳，在U VP凝膠成像系統(tǒng)下成像保存。測序由上海生物工程有限公司完成。

試驗(yàn)選用樣本正反向測序。用BioEdit的ClustalW分別進(jìn)行序列對位排列分析，對有N值和計算機(jī)誤讀的個別剪輯進(jìn)行人工校對。對獲得的序列進(jìn)行序列分析。將測得的I TS序列在Gene Bank進(jìn)行BLAST，從GeneBank核酸序列數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比對，獲得相似率較高、親源關(guān)系較近的物種，研究其中的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系。采用ME G A4.0系統(tǒng)發(fā)育分析軟件中的UPGMA法構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹［2,3］。

1.2.2 回接試驗(yàn)復(fù)制病害典型特征

根據(jù)科赫式法則進(jìn)行回接試驗(yàn)，將分離出的真菌分別與黑木耳菌進(jìn)行回接試驗(yàn)，定期觀察，記錄發(fā)病情況。同期將病原菌unknownfungi和黑木耳“黑29”轉(zhuǎn)入養(yǎng)基配方、體積、重量、接菌時間、培養(yǎng)時間及培養(yǎng)條件等完全相同的菌袋中，并保留空白菌袋做對照。經(jīng)過2w的培養(yǎng)以后，載有病原菌unknownfungi菌袋出現(xiàn)了與病原地所采集樣品同樣的發(fā)病特征，證明病原菌unknownfungi即為黑木耳“黑皮病”的致病菌。

1.2.3 病原菌宏觀形態(tài)鑒定

1.2.3.1 病原菌菌落形態(tài)

用直徑為5mm的打孔器沿菌落邊緣，打取菌齡一致的菌餅，接種于改良PDA培養(yǎng)基斜面中央，然后于25℃恒溫箱中培養(yǎng)。從第3 d開始，每隔24 h測量一次菌落直徑，直到菌絲最前端接近平板培養(yǎng)基邊緣為止。

1.2.3.2 菌絲、分生孢子及真子座型載孢體形態(tài)

將病原菌菌株轉(zhuǎn)接至改良PDA培養(yǎng)基上，培養(yǎng)

表1 ITS序列擴(kuò)增反應(yīng)體系表Tab.1 System table of ITS sequence amplified reaction

2 結(jié)果與分析

2.1 形態(tài)學(xué)鑒定

2.1.1 菌落形態(tài)

斜面（見圖2）內(nèi)菌絲萌發(fā)時為白色，菌落具有發(fā)達(dá)的菌絲體。在24℃的培養(yǎng)條件下，菌絲長勢旺盛，在固體培養(yǎng)基中，菌絲向培養(yǎng)基內(nèi)深入，在距離表面約1mm厚的區(qū)域內(nèi)形成菌絲層。隨著培養(yǎng)時間的延長，菌絲向氣相延展，并開始變色，菌絲大量聚集的區(qū)域變?yōu)樯詈谏?，斜面末端呈黑灰色，后期全部變?yōu)楹谏Ｔ摼谛泵嬷兄挥^察到菌絲，未能觀察到其他結(jié)構(gòu)。

圖2 菌落形態(tài)圖Fig.2 Aspectgraph of colony

2.1.2 菌絲、分生孢子形態(tài)及真子座型載孢體

2.1.2.1 菌絲（見圖3-A）

菌絲體初期白色，逐漸變?yōu)楹稚?后期逐漸變?yōu)楹谏蕯U(kuò)散狀生長，有氣生菌絲，接種后6d長滿直徑9 cm平板，生長速度平均為0.75c m/d，菌絲體寬度（2.4）3～7（8.5）μm，有隔，光滑，菌絲體中段有分叉，形成新的菌絲體。

2.1.2.2 真子座型載孢體（見圖3-B、C）

真子座型載孢體，黑色，呈球形或近球形，大小為(89)105～260(285)μm×(89)105～260(285)μm，有明顯的外壁，外壁厚度(9)11～17(18.5)μm。分生孢子通過分生孢子梗連接于載孢體內(nèi)壁，頂端無凸起或短小凸起，有頂孔，用于釋放分生孢子。

2.1.2.3 分生孢子（見圖 3-E、F、G、H）

分生孢子呈橢圓形或亞圓形，表面光滑，兩端鈍圓,初期無隔，無色，大小為(10.7)14～18（22.7）μm×(7.5)8.2～11（13.7）μm。后期于孢子中間產(chǎn)生一個隔膜，形成二孢結(jié)構(gòu)，且孢子變?yōu)楹稚蚝谏７稚咦俞尫乓院?，形成分生孢子束，分生孢子束肉眼可見，淺黃色或黃色，直徑0.4～1.0mm。

圖3 病原菌結(jié)構(gòu)顯微觀察圖Fig.3 Microscopic graph of pathogen

該菌形態(tài)特征與已知品種可可毛色二孢菌Lasiodiplodia theobromae基本一致，初步確定該菌株為可可毛色二孢菌Lasiodiplodia theobromae。

2.2 序列分析

2.2.1 I TS擴(kuò)增結(jié)果及分析

I TS-PCR產(chǎn)物電泳結(jié)果如圖4所示，M ar k er為D L2000，1號泳道為病原菌，2號泳道為去離子水對照。供試菌株的I TS產(chǎn)物大小在500～750 b p，測序結(jié)果顯示，供試菌株I TS序列為533 b p（見圖5）。

圖4 ITS產(chǎn)物擴(kuò)增電泳圖Fig.4 Electrophoretogram of ITS products amplified

圖5 病原菌ITS序列圖Fig.5Sequence diagram of ITS pathogen

2.2.2 I TS序列系統(tǒng)發(fā)育分析

用已經(jīng)獲得的病原菌ITS序列在GenBank中比對，與相似度最高的11個不同品種的已知序列建立進(jìn)化樹，各品種序列名稱及GenBank號見表2。

表2 毛雙孢屬Lasiodiplodia(Botryosphaeria為有性階段)Tab.2 Lasiodiplodia(Botryosphaeria in perfect stage)11個種的ITS序列名稱及號碼表

由圖6可知，各分枝內(nèi)菌株間的最大遺傳距離在0.003 892，最小為0.0000，說明各分枝內(nèi)菌株的ITS 差異很小，11 個品種具有極強(qiáng)的相似性，但又略有區(qū)別，證明所有品種來源于同一個屬，即毛雙孢屬Lasiodiplodia 。其中病原菌（unknown fungi）與已知種Lasiodiplodia theobromae，GenBank 編號EU918707 的序列遺傳距離差異為0.0000，經(jīng)比對其相似度為99.999 %，結(jié)合宏觀經(jīng)典分類學(xué)數(shù)據(jù)進(jìn)一步確定該病原菌為可可毛色二孢菌Lasiodiplodia theobromae。其生物學(xué)分類為子囊菌綱Ascomycetes、假球殼目Pleosporales、葡萄座腔菌科Botryosphaeriaceae、毛雙孢屬Lasiodiplodia、可可毛色二孢菌Lasiodiplodia theobromae。

圖6 病原菌（unknown fungi）菌株與毛雙孢屬Lasiodiplodia 11個種的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.6 Phylogenetic tree of pathogen strains and 11 species of Lasiodiplodia

3 結(jié)論

黑木耳“黑皮病”的病原菌，經(jīng)過分離純化、形態(tài)鑒定和分子生物學(xué)鑒定后，確定為可可毛色二孢菌Lasiodiplodia theobromae。

4 討論

通過與GenBank中的序列比對，在已公布序列的菌種中，本文中的病原菌菌株與可可毛色二孢菌Lasiodiplodia theobromae遺傳距離最近，且相似度最高。結(jié)合宏觀形態(tài)和分子生物學(xué)分析結(jié)果可以確定該病原菌為可可毛色二孢菌Lasiodiplodia theobromae。本文中可可毛色二孢菌Lasiodiplodia theobromae，是該菌的無性世代，該菌還有異名Botryosphaeria theobromae.和Diplodia gossypina等。該菌的有性型屬于子囊菌葡萄座腔菌科Botryosphaeriaceae屬，在本次試驗(yàn)中未能觀察到。

目前，國內(nèi)外鮮有可可毛色二孢菌作為黑木耳病害的研究報道，尤其在我國東北黑木耳主產(chǎn)區(qū)該病害出現(xiàn)的時間不長，但是污染規(guī)模和造成的損失有逐年遞增的趨勢。隨著研究的不斷深入，我們也發(fā)現(xiàn)該病害如果在黑木耳菌絲成活以后侵染黑木耳菌袋，則不會造成黑木耳絕產(chǎn)。通過拮抗實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)病原菌與黑木耳菌絲之間有明顯的分割線，說明黑木耳菌絲體對該病有一定的抵抗能力，可與其共生，在黑木耳子實(shí)體形成期也可獲得部分黑木耳子實(shí)體，但是整體產(chǎn)量將大幅下降。由于該病原菌與黑木耳菌絲生長、生殖所必須的營養(yǎng)、溫度、濕度、pH、水分等基礎(chǔ)條件有巨大的交集，因此對可可毛色二孢菌病害的防治造成較大困難，目前只能通過嚴(yán)格控制其進(jìn)入菌袋，隔絕其接觸菌袋內(nèi)的培養(yǎng)基來防止這類病害的發(fā)生。目前缺乏病原菌侵入菌袋后的治療方法，希望通過后續(xù)研究能夠找到應(yīng)對該病害的合理措施。

［1］ 李慧蓉.白腐真菌生物學(xué)和生物技術(shù)［M］.北京：化學(xué)工業(yè)出版社，2005：76-88.

［2］ 劉佳寧，宋瑞清.扎龍濕地水生真菌多樣性研究［D］.哈爾濱：東北林業(yè)大學(xué)，2008.

［3］ 宋瑞清，余江勇，冀瑞卿.四個姬松茸菌株rDNA ITS序列比較［J］.林業(yè)科技，2007，（03）:23-24.