付偉 鄧?yán)蛱m 徐勝 何興元 陳瑋 趙詣 張娜 蘇麗麗

(西南林業(yè)大學(xué)，昆明，650224) (森林與土壤生態(tài)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室(中國(guó)科學(xué)院沈陽(yáng)應(yīng)用生態(tài)研究所))

責(zé)任編輯:潘 華。

臭氧(O3)是常見(jiàn)的植物性毒素空氣污染物。政府間氣候變化專門委員會(huì)第四次評(píng)估報(bào)告指出［1］，自工業(yè)革命以來(lái)，由于O3前體物如氮氧化物(NOx)、一氧化碳(CO)、揮發(fā)性有機(jī)氣體(VOCs)等排放增加［2］，對(duì)流層中O3摩爾分?jǐn)?shù)在近30 a來(lái)以每年0．5%～2．0%的速度上升，預(yù)計(jì)到2100年O3摩爾分?jǐn)?shù)可達(dá)84×10－9。受污染地區(qū)的局地較高地表溫度將會(huì)觸發(fā)區(qū)域化學(xué)和局地排放反饋，進(jìn)一步推高臭氧峰值水平［3］。我國(guó)京津唐和長(zhǎng)江三角洲等地區(qū)近地層O3短期摩爾分?jǐn)?shù)最高已達(dá)到150×10－9［4－5］，對(duì)人和動(dòng)植物造成嚴(yán)重影響。目前全球森林的30%已遭受到O3的不利影響，預(yù)計(jì)到21世紀(jì)末將達(dá)到49%［6］。高摩爾分?jǐn)?shù)O3已被證實(shí)對(duì)植物生理功能、生長(zhǎng)發(fā)育、產(chǎn)量等造成顯著負(fù)面影響［7－10］。

氣孔是陸生植物與外界環(huán)境氣體交換和水分交換的主要通道及調(diào)節(jié)器官［11］，氣孔雖小，但對(duì)植物水分利用、營(yíng)養(yǎng)吸收、物質(zhì)代謝等方面以及整個(gè)生態(tài)環(huán)境的調(diào)節(jié)起重要作用［12］。氣孔大小及氣孔開(kāi)度大小決定了進(jìn)入植物體內(nèi)O3的量，其變化與O3對(duì)植物的傷害關(guān)系較大［13］。高摩爾分?jǐn)?shù)O3對(duì)植物氣孔影響已有的研究表明，O3摩爾分?jǐn)?shù)升高脅迫下植物葉片的氣孔結(jié)構(gòu)受到損傷，氣孔開(kāi)度降低、密度增大等［13－15］。徐文鐸等［16］對(duì)銀杏和李梅等［17］對(duì)水蠟的研究表明，O3摩爾分?jǐn)?shù)升高下兩樹(shù)種成熟葉片氣孔密度無(wú)顯著變化。Paoletti［18］用110×10－9摩爾分?jǐn)?shù)O3對(duì)草莓樹(shù)(Arbutus unedo)熏蒸90 d后發(fā)現(xiàn)其氣孔開(kāi)度未顯著降低。Paoletti和Grulke［19］對(duì)食莢菜豆(Phaseolus vulgaris)和加州櫟(Quercus kelloggii)等3種植物的研究發(fā)現(xiàn)，摩爾分?jǐn)?shù)為70×10－9O3脅迫1～2個(gè)月后它們的氣孔開(kāi)度反而增大，并認(rèn)為其原因是高摩爾分?jǐn)?shù)O3會(huì)延遲氣孔反應(yīng)時(shí)間，增加氣孔開(kāi)閉時(shí)間，有些氣孔夜間仍處于不完全關(guān)閉狀態(tài)。相關(guān)研究結(jié)果存在較大差異，很難準(zhǔn)確評(píng)價(jià)O3脅迫對(duì)植物氣孔運(yùn)動(dòng)影響，同時(shí)也不利于評(píng)價(jià)O3對(duì)不同植物的影響和危害。

黃檗(Phellodendron amurense Rupr．)是我國(guó)東北地區(qū)3大硬闊葉樹(shù)種之一，在沈陽(yáng)已被廣泛應(yīng)用于城市園林綠化。目前對(duì)黃檗已有較多的研究，但多集中在化學(xué)成分及藥物等方面［20］，生理生態(tài)等方面研究較少［21－22］。而有關(guān)大氣O3摩爾分?jǐn)?shù)升高對(duì)黃檗氣孔特征等的影響研究還未見(jiàn)有報(bào)道。本試驗(yàn)旨在研究高摩爾分?jǐn)?shù)O3脅迫下黃檗葉片氣孔特征影響，揭示O3脅迫對(duì)葉片氣孔的影響，為更好評(píng)價(jià)高摩爾分?jǐn)?shù)O3對(duì)植物的危害提供理論依據(jù)，同時(shí)也為全球氣候變化背景下珍貴植物黃檗的種質(zhì)保護(hù)、開(kāi)發(fā)及利用提供科學(xué)依據(jù)和實(shí)踐指導(dǎo)。

1 材料與方法

研究區(qū)位于中國(guó)科學(xué)院沈陽(yáng)樹(shù)木園內(nèi)，是沈陽(yáng)市人口密集的商業(yè)文化中心地帶。本試驗(yàn)采用開(kāi)頂箱(OTC)氣體熏蒸法，試驗(yàn)主要設(shè)施為結(jié)構(gòu)和性能完整的4個(gè)OTCs(直徑4 m、高3 m的正八邊形玻璃室壁)及與其配套的通氣、通風(fēng)設(shè)備。試驗(yàn)于2013年7—9月進(jìn)行，設(shè)置對(duì)照組AA(背景大氣，約((40±5)×10－9)和3組不同摩爾分?jǐn)?shù)O3處理，設(shè)定值依次為T1((60±5)×10－9)、T2((80±10)×10－9)和T3((120±10)×10－9)。

2013年5月底將4年生黃檗(Phellodendron amurense Rupr．)幼苗重新移入上口徑28 cm，高30 cm的塑料花盆內(nèi)，培養(yǎng)基質(zhì)為V(壤土)∶V(草炭)∶V(沙土)=5∶3∶2的混合土壤，溫室培養(yǎng)60 d后，于2013年7月31日選取生長(zhǎng)狀況良好，高度基本一致的盆栽黃檗幼苗移入OTCs內(nèi)，每個(gè)摩爾分?jǐn)?shù)的OTC內(nèi)放置3盆作為重復(fù)并開(kāi)始通氣處理，熏蒸時(shí)間為每天09:00—16:00(雷雨天等惡劣天氣停止通氣)，9月25日停止通氣，共處理56 d。整個(gè)熏蒸處理期OTCs內(nèi)管理方法一致，水肥等條件控制一致。

可見(jiàn)傷害癥狀:對(duì)高摩爾分?jǐn)?shù)O3熏蒸下黃檗葉開(kāi)始出現(xiàn)可見(jiàn)癥狀進(jìn)行觀察和記錄，并于氣體熏蒸第49 d時(shí)統(tǒng)計(jì)可見(jiàn)傷害(出現(xiàn)壞死性斑塊等癥狀的面積)百分比。單葉可見(jiàn)傷害比通過(guò)隨機(jī)選取各OTC內(nèi)黃檗幼苗的葉片(5片/株)，用Photoshop CS5計(jì)算得出;單株葉片可見(jiàn)傷害比=觀察到可見(jiàn)癥狀的葉片數(shù)/植株全部葉片數(shù)(含幼葉和成熟葉)。

掃描電鏡觀察:不同摩爾分?jǐn)?shù)O3熏蒸56 d后，在9月25日(晴天)上午10:00時(shí)左右采集各開(kāi)頂箱內(nèi)黃檗幼苗形態(tài)學(xué)上部、奇數(shù)羽狀復(fù)葉中部發(fā)育階段相近的新生成年葉片，每株黃檗幼苗選取2片大小均勻，無(wú)病蟲(chóng)害的葉片(80×10－9、120×10－9摩爾分?jǐn)?shù)O3開(kāi)頂箱內(nèi)采集的葉片有壞死斑)。將取下的葉片迅速用蒸餾水輕輕漂洗后，用鋒利刀片將葉片中脈兩側(cè)(中部)的部分，各切下約6 mm×6 mm的小塊2塊，放入裝有2．5%戊二醛的透明玻璃小瓶固定，于冰箱4℃保存。顯微觀察前，將經(jīng)戊二醛固定的葉片樣品用磷酸緩沖液(pH=7．2、0．1 mol·L－1)清洗3次，然后用70%、80%、90%、95%、100%5個(gè)體積分?jǐn)?shù)酒精脫水，各梯度均脫水5 min，最后用純叔丁醇置換2次。再用國(guó)產(chǎn)LGJ－10c型冷凍干燥機(jī)真空冷凍干燥，待自封袋內(nèi)的冰晶揮發(fā)后取出，將切好的樣品用雙面膠固定到樣品臺(tái)上，再用精密刻蝕噴鍍儀鍍金后置于環(huán)境電子掃描顯微鏡(Quanta－250，國(guó)產(chǎn))下進(jìn)行觀察拍照。每個(gè)處理觀察30個(gè)視野(600倍、5 000倍)并拍照。計(jì)算每幅圖片上的氣孔個(gè)數(shù)，除以該圖片面積，統(tǒng)計(jì)每1 mm2葉片上的氣孔數(shù)目，即為氣孔密度。同時(shí)，在單個(gè)氣孔(5 000倍)圖片上測(cè)量各氣孔的長(zhǎng)度、寬度、周長(zhǎng)、面積及氣孔開(kāi)放口的長(zhǎng)度和寬度。氣孔長(zhǎng)度為平行于氣孔器的最長(zhǎng)值，氣孔寬度為垂直于氣孔器的最寬值，氣孔面積通過(guò)Photoship CS5算出;氣孔比=氣孔長(zhǎng)度/氣孔寬度［16－17］。所有數(shù)據(jù)采用Microsoft Office Excel 2007和PASW 18．0軟件統(tǒng)計(jì)分析，相關(guān)性分析采用(Pearson，two－tailed)分析得出。

2 結(jié)果與分析

2．1 高摩爾分?jǐn)?shù)O3對(duì)黃檗葉片可見(jiàn)傷害癥狀的影響

高摩爾分?jǐn)?shù)O3(120×10－9)熏蒸6 d后(第6天癥狀出現(xiàn)時(shí)的臭氧傷害劑量為29．60 mmol·mol－1·h－1，典型傷害癥狀為葉片邊緣及近中脈首先出現(xiàn)漂白色褪綠斑點(diǎn)，隨著熏蒸時(shí)間延長(zhǎng)，斑點(diǎn)逐漸擴(kuò)大成斑塊，顏色變?yōu)辄S褐色，其余部分變黃。)對(duì)黃檗葉片開(kāi)始產(chǎn)生可見(jiàn)傷害癥狀。癥狀先出現(xiàn)在葉邊緣及近中脈，并隨熏蒸時(shí)間的延長(zhǎng)而加劇，表現(xiàn)出積累效應(yīng)。

不同摩爾分?jǐn)?shù)O3熏蒸49 d后，與對(duì)照相比，80×10－9和120×10－9兩處理組黃檗單葉傷害面積比和單株葉可見(jiàn)傷害比極顯著增加(P＜0．01)(表1)，增幅分別為48．2%、77．7%和96．2%及62．4%。而O3摩爾分?jǐn)?shù)為60×10－9時(shí)差異不顯著(P＞0．05)。表明黃檗對(duì)小于80×10－9摩爾分?jǐn)?shù)O3表現(xiàn)出一定的抗性。

表1 不同摩爾分?jǐn)?shù)O3對(duì)黃檗葉片可見(jiàn)傷害率的影響 %

2．2 高摩爾分?jǐn)?shù)O3對(duì)黃檗葉片氣孔大小參數(shù)的影響

從掃描電鏡觀察的結(jié)果來(lái)看(圖1)，黃檗氣孔分布于葉片的下表皮，散生于葉脈間，各處理組氣孔呈近橢圓形，氣孔外拱蓋隆起，氣孔外拱蓋內(nèi)緣近平滑［23］。但經(jīng)過(guò)56 d的不同摩爾分?jǐn)?shù)O3熏蒸處理后，黃檗葉片氣孔大小參數(shù)發(fā)生顯著變化(表2)，具體表現(xiàn)為:與對(duì)照組相比，摩爾分?jǐn)?shù)為120×10－9處理組氣孔長(zhǎng)度和寬度均極顯著降低(P＜0．01)，降幅分別為17．47%和21．44%。摩爾分?jǐn)?shù)為80×10－9組氣孔寬度顯著降低34．4%，但氣孔長(zhǎng)度降低不顯著(P＞0．05)。T2、T3組氣孔開(kāi)度長(zhǎng)和開(kāi)度寬亦極顯著降低(P＜0．01)，降幅依次為21．45%、24．03%及57．40%、53．03%。摩爾分?jǐn)?shù)為80×10－9、120×10－9組的氣孔周長(zhǎng)和氣孔面積也呈現(xiàn)出極顯著降低趨勢(shì)(P＜0．01)，呈現(xiàn)O3摩爾分?jǐn)?shù)越高，降幅越大的趨勢(shì)。兩組處理的氣孔周長(zhǎng)降幅分別為12．87%和21．70%，氣孔面積降幅分別為34．6%和45．5%。對(duì)各組的氣孔周長(zhǎng)和氣孔面積進(jìn)行相關(guān)性分析表明，除了對(duì)照組的氣孔周長(zhǎng)和氣孔面積存在顯著的正相關(guān)外(n=15，R2=0．67，P＜0．05)，各處理組兩變量之間均存在極顯著的正相關(guān)性(n=15，P＜0．01)。O3摩爾分?jǐn)?shù)60×10－9處理下，黃檗葉片下表皮氣孔大小參數(shù)變化幅度較小，除氣孔寬度和開(kāi)口寬與對(duì)照相比顯著降低外(P＜0．05)，降幅為12．0%和27．9%。其它各指標(biāo)略降低，但均無(wú)顯著變化(P＞0．05)。氣孔大小參數(shù)與臭氧摩爾分?jǐn)?shù)之間的相關(guān)性可以用一元二次曲線方程較好的描述(P＜0．01)。

表2 不同摩爾分?jǐn)?shù)O3對(duì)黃檗葉片氣孔大小參數(shù)影響

2．3 高摩爾分?jǐn)?shù)O3對(duì)黃檗葉片氣孔密度和氣孔比的影響

不同摩爾分?jǐn)?shù)O3熏蒸處理56 d后，與對(duì)照相比，80×10－9、120×10－9摩爾分?jǐn)?shù)下黃檗葉片氣孔密度極顯著增加(P＜0．01)(表3)，分別增加37．26%和35．12%，兩組摩爾分?jǐn)?shù)間差異不顯著;60×10－9摩爾分?jǐn)?shù)下的氣孔密度變化不顯著(P＞0．05)。

表3 不同摩爾分?jǐn)?shù)O3熏蒸下黃檗葉片下表皮氣孔密度和氣孔比的變化

隨O3摩爾分?jǐn)?shù)升高，黃檗葉片的氣孔比呈逐漸增加趨勢(shì)，當(dāng)O3摩爾分?jǐn)?shù)增加到80×10－9時(shí)，氣孔比達(dá)到最大的3．52，與對(duì)照相比極顯著增加41．31%，之后氣孔比有降低的趨勢(shì)，但仍與對(duì)照呈極顯著差異(P＜0．01)，增幅為37．23%。表明高摩爾分?jǐn)?shù)O3脅迫對(duì)黃檗葉片氣孔數(shù)量和大小發(fā)育影響作用較大，且在80×10－9時(shí)氣孔密度和氣孔比達(dá)到最大。

3 討論與結(jié)論

葉片可見(jiàn)傷害癥狀是植株在高摩爾分?jǐn)?shù)O3環(huán)境中受到傷害后表現(xiàn)出的直觀癥狀，這種癥狀主要是由于O3通過(guò)葉下表皮開(kāi)放的氣孔進(jìn)入組織細(xì)胞中并與細(xì)胞壁和質(zhì)膜上的物質(zhì)反應(yīng)而產(chǎn)生，闊葉樹(shù)種往往表現(xiàn)為葉片變紅或變褐色，但因樹(shù)種不同而異［6，24－25］。Vapaavuori等［26］研究發(fā)現(xiàn)O3傷害劑量達(dá)到28 mmol·mol－1·h－1時(shí)垂枝樺葉片出現(xiàn)可見(jiàn)傷害癥狀。本試驗(yàn)中，黃檗葉片在高摩爾分?jǐn)?shù)臭氧熏蒸下6 d、O3傷害劑量為29．6 mmol·mol－1·h－1時(shí)出現(xiàn)漂白色的可見(jiàn)傷害癥狀，并隨著熏蒸時(shí)間延長(zhǎng)傷害加劇。O3摩爾分?jǐn)?shù)高于80×10－9時(shí)對(duì)黃檗單葉傷害面積比和單株葉可見(jiàn)傷害比極顯著增加，而低于該摩爾分?jǐn)?shù)時(shí)變化較小。表明黃檗對(duì)低于80×10－9摩爾分?jǐn)?shù)O3表現(xiàn)出一定的抗性。

圖1 不同摩爾分?jǐn)?shù)O3處理黃檗葉片下表皮氣孔的掃描電鏡觀察(×5000)

在全球氣候變化背景下，當(dāng)植物葉片出現(xiàn)可見(jiàn)傷害癥狀時(shí)，用顯微觀察分析確認(rèn)，可能成為O3或其他污染物脅迫下植物診斷的有效手段，同時(shí)也能評(píng)估不同樹(shù)種在不同脅迫因子下的適應(yīng)能力［15］。氣孔是控制CO2進(jìn)入葉肉細(xì)胞和水分蒸騰散失的重要門戶，氣孔的變化會(huì)對(duì)植物的生長(zhǎng)產(chǎn)生重要影響。已有的研究表明，O3脅迫對(duì)垂枝樺(Betula pendula)和土豆葉片細(xì)胞和氣孔結(jié)構(gòu)造成損傷［14，27］。文志等［13］研究表明，高摩爾分?jǐn)?shù)O3(約100×10－9)熏蒸處理110 d元寶楓葉片氣孔大小參數(shù)顯著下降。本研究表明，與對(duì)照相比，80×10－9、120×10－9摩爾分?jǐn)?shù)O3處理下黃檗幼苗葉片的氣孔長(zhǎng)度、寬度、氣孔開(kāi)度及氣孔周長(zhǎng)和面積均顯著下降(P＜0．01)(除80×10－9時(shí)氣孔長(zhǎng)降低不顯著外)，且O3摩爾分?jǐn)?shù)越高，降幅越大，并有少數(shù)氣孔出現(xiàn)完全閉合現(xiàn)象。而60×10－9摩爾分?jǐn)?shù)處理時(shí)其氣孔寬度和氣孔開(kāi)口寬下降明顯，其他氣孔大小參數(shù)變化較小(P＞0．05)。各處理組氣孔周長(zhǎng)與氣孔面積之間存在極顯著的正相關(guān)，氣孔周長(zhǎng)和面積相互影響。產(chǎn)生這種現(xiàn)象的原因可能是O3進(jìn)入植物細(xì)胞后，誘導(dǎo)植物葉片細(xì)胞內(nèi)(包括保衛(wèi)細(xì)胞)產(chǎn)生H2O2，H2O2作為信號(hào)分子與下游信號(hào)分子級(jí)聯(lián)反應(yīng)導(dǎo)致氣孔關(guān)閉［28］。李梅等［17］對(duì)水蠟的研究得出類似結(jié)果。但Paoletti［18］和Grulke［19］對(duì)加州黑櫟等3種植物的研究發(fā)現(xiàn)，不管穩(wěn)態(tài)光還是動(dòng)態(tài)光下，O3脅迫后它們的氣孔開(kāi)度反而增大，認(rèn)為高摩爾分?jǐn)?shù)O3會(huì)延遲氣孔反應(yīng)時(shí)間，氣孔開(kāi)閉時(shí)間增加，有些氣孔夜間仍處于不完全關(guān)閉狀態(tài)。Hassan等［29］通過(guò)對(duì)埃及蘿卜的研究發(fā)現(xiàn)，高摩爾分?jǐn)?shù)O3能引發(fā)其表皮細(xì)胞部分破裂，從而導(dǎo)致氣孔開(kāi)度增大。因此，相比氣孔指數(shù)，氣孔密度值更能反映出大氣O3摩爾分?jǐn)?shù)升高對(duì)氣孔數(shù)量變化的關(guān)系［16］。本研究中，80×10－9和120×10－9摩爾分?jǐn)?shù)O3處理下黃檗幼苗葉片的氣孔密度顯著增加(P＞0．01)，兩組處理間無(wú)顯著差異，60×10－9摩爾分?jǐn)?shù)處理時(shí)增幅不顯著(P＞0．05)。這與Giacomo等［15］研究結(jié)果一致。徐文鐸等［16］對(duì)銀杏和李梅等［17］對(duì)水蠟的研究結(jié)果表明O3摩爾分?jǐn)?shù)升高處理下葉片氣孔密度未顯著增加，認(rèn)為取樣的材料是成年葉片，而氣孔產(chǎn)生和形成是在葉片發(fā)生早期，本實(shí)驗(yàn)中高摩爾分?jǐn)?shù)O3處理下黃檗葉片氣孔密度的增加可以認(rèn)為是一種有益的生理生態(tài)適應(yīng)機(jī)制的表現(xiàn)，通過(guò)減輕單個(gè)氣孔對(duì)O3的負(fù)荷，使O3在葉內(nèi)組織均勻分布，從而形成一個(gè)良好的排毒過(guò)程［30］，黃檗在80×10－9左右O3摩爾分?jǐn)?shù)時(shí)能通過(guò)調(diào)控氣孔發(fā)育等積極響應(yīng)來(lái)適應(yīng)變化的環(huán)境，從而減少傷害。這也表明不同樹(shù)種對(duì)O3摩爾分?jǐn)?shù)的敏感性存在差異，O3摩爾分?jǐn)?shù)對(duì)氣孔性狀的影響與控制試驗(yàn)的時(shí)間長(zhǎng)短或植物的種類有關(guān)，同時(shí)也表明植物既可以短期調(diào)節(jié)氣孔開(kāi)度又可以長(zhǎng)期控制氣孔發(fā)育和形態(tài)來(lái)適應(yīng)環(huán)境的變化［12］。氣孔比隨O3摩爾分?jǐn)?shù)升高增大，80×10－9時(shí)達(dá)到最大，隨后降低。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，80×10－9摩爾分?jǐn)?shù)O3處理下氣孔在氣孔長(zhǎng)度較大的情況下，氣孔寬度顯著降低，而氣孔寬度的降低又是通過(guò)最大程度的降低氣孔開(kāi)度(表3)。這說(shuō)明O3對(duì)植物影響有累積性，黃檗可以忍耐低于80×10－9的O3摩爾分?jǐn)?shù)，當(dāng)黃檗O3積累吸收量超過(guò)了自身解毒能力，氣孔結(jié)構(gòu)受損，其發(fā)育受到影響。

綜上所述，高摩爾分?jǐn)?shù)O3熏蒸黃檗幼苗葉片產(chǎn)生明顯漂白色褪綠斑點(diǎn)等傷害癥狀，并隨熏蒸時(shí)間延長(zhǎng)而加劇。經(jīng)過(guò)56 d熏蒸處理，O3摩爾分?jǐn)?shù)為60×10－9時(shí)黃檗葉片下表皮氣孔寬度和開(kāi)口寬顯著減小，而氣孔周長(zhǎng)等其他參數(shù)無(wú)顯著變化。當(dāng)O3摩爾分?jǐn)?shù)上升到80×10－9和120×10－9時(shí)，其氣孔大小極參數(shù)顯著降低。氣孔密度和氣孔比在80×10－9時(shí)達(dá)到最大。推測(cè)(80±10)×10－9是黃檗幼苗O3脅迫忍耐性的臨界點(diǎn)。

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