彭 森，陳昌旭，封曉茹，許美玉

(北京林業(yè)大學(xué)生物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院食品科學(xué)與工程系/林業(yè)食品加工與安全北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100083)

核桃仁除含有營(yíng)養(yǎng)價(jià)值高的油脂外，蛋白質(zhì)含量也高達(dá)14%～17%［1］。目前人們注重核桃仁油的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值與利用，而制油后產(chǎn)生的大量的核桃仁粕還沒有得到很好的利用［2］。蛋白質(zhì)是脫脂核桃仁粕的主要成分，其含量可達(dá)54%，含有18 種氨基酸(包括8 種必需氨基酸)［3］。核桃仁蛋白具有抗氧化作用，隨著核桃仁蛋白肽濃度的增加，其還原能力、羥自由基的清除能力和超氧陰離子清除能力增大［4］。核桃仁蛋白酶水解物對(duì)大腸桿菌、枯草桿菌和金黃色葡萄球菌均有抑制作用，且隨著水解度的增加，酶解物的抑菌能力增強(qiáng)［5］。研究表明，核桃仁蛋白木瓜酶水解物對(duì)MCF-7 人乳腺癌細(xì)胞的增殖具有顯著的抑制作用［6］，然而其活性成分尚不清楚。蛋白酶水解物中，肽的分子量與生物活性具有密切關(guān)系［7-8］。研究表明，小分子量多肽具有較強(qiáng)的生物活性，如大豆多肽、牛乳鐵蛋白、麥胚蛋白等［9-11］。本文采用超濾技術(shù)，按分子量大小對(duì)核桃仁蛋白木瓜酶水解物進(jìn)行分離，對(duì)具有較強(qiáng)活性的組分進(jìn)行氨基酸含量分析，為闡明核桃仁源抗癌活性肽結(jié)構(gòu)特點(diǎn)提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

核桃(河北晶品果業(yè)有限公司);木瓜蛋白酶(北京科百奧生物技術(shù)有限公司);人乳腺癌細(xì)胞MCF-7(北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院細(xì)胞中心);酶標(biāo)儀(BIO-RAD);MEM-EBSS、DEME (北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院細(xì)胞中心);胎牛血清(Hyclone);噻唑藍(lán)MTT 粉劑(美國(guó)Sigma 公司);二甲基亞砜DMSO (北京化工廠);1mol/L 鹽酸HCl、1mol/L 氫氧化鈉NaOH、0.1 mol/L 氫氧化鈉NaOH (按GB/T601 規(guī)定的方法配制和標(biāo)定)。

1.2 方法

1.2.1 核桃仁蛋白的提取 根據(jù)參考文獻(xiàn)［12］，核桃仁去皮磨粉，石油醚充分提取油脂。取一定量烘干的脫脂核桃仁粉，加入1 mol/L NaOH 溶液，按照核桃仁粉:NaOH 溶液為1∶20 (W/V)配成溶液，調(diào)節(jié)pH 至9。55℃超聲提取1 h，過濾、棄渣。濾液4℃，3 000r/min離心30min，取上清液。用1 mol/L HCl 調(diào)節(jié)上層清液的pH 至4.5，4℃、3 000r/min 離心10min，取下層沉淀。用少量水稀釋，調(diào)pH 至7，冷凍干燥。

1.2.2 核桃仁蛋白酶水解物制備 稱取3g 冷凍干燥后的核桃蛋白，加蒸餾水90mL 進(jìn)行溶解，制備成核桃蛋白溶液;另稱取0.3g 木瓜蛋白酶，用適量蒸餾水溶解制備成溶液。木瓜蛋白酶的最適水解條件為37℃、pH7.0，在此條件下，將木瓜蛋白酶溶液加入到核桃蛋白溶液中，振蕩混勻，實(shí)時(shí)滴加0.1mol/L NaOH，控制其pH 值恒定。3h 后，水解完畢，調(diào)節(jié)pH 值至中性。在95℃高溫水浴下加熱處理水解液10min，用于滅活木瓜蛋白酶，以終止水解反應(yīng)。用超速冷凍離心機(jī)離心，3 000r/min、2～4℃離心30min，收集上清液。用冷凍干燥機(jī)，將所得上清液冷凍干燥。

1.2.3 超濾法分離核桃蛋白酶水解物 稱取一定量核桃蛋白木瓜酶水解物配制成溶液，將溶液通過0.45μm水系膜進(jìn)行過濾。再將過濾后的溶液通過不同截留分子量超濾膜，依次將核桃蛋白水解產(chǎn)物分離為10kDa ＞MW ＞5kDa、5kDa ＞MW ＞3kDa 和MW ＜3kDa 等3 個(gè)不同分子量的組分，并冷凍干燥。

1.2.4 MTT 細(xì)胞增殖分析試驗(yàn) 用DMEM 培養(yǎng)基，補(bǔ)充10%胎牛血清、0.5%雙抗(20 000 單位/mL)的完全培養(yǎng)液，將MCF-7 細(xì)胞懸液密度調(diào)整為3 ×104個(gè)/mL，混合均勻后接種于96 孔板，每孔100μL，放置于37℃、5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育24h。棄去上清液，貼壁細(xì)胞用于細(xì)胞實(shí)驗(yàn)。以每孔100μL 于實(shí)驗(yàn)孔和對(duì)照孔中分別加入含有樣品的及不含樣品的完全培養(yǎng)基，放置于37℃，5% CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育48h。每孔加入20μL 的5mg/mL 噻唑藍(lán)MTT 液，放置于37℃，5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)5h。5h 后，吸除上清液，每孔加入200μL 的二甲基亞砜DMSO，以終止培養(yǎng)。置于搖床上避光低速震蕩15min，使用酶標(biāo)儀測(cè)定570nm 波長(zhǎng)處的吸光度值。

1.2.5 氨基酸含量測(cè)定 制備10kDa ＞MW ＞5kDa 組分、5kDa ＞MW ＞3kDa 組分和MW ＜3kDa 組分，用日立L-8900全自動(dòng)氨基酸分析儀(Hitachi，Tokyo，Japan)檢測(cè)。

1.2.6 統(tǒng)計(jì)分析 數(shù)據(jù)用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差來表示，由SPSS 軟件來評(píng)價(jià)不同組中的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P ＜0.05 視為顯著［13］。

2 結(jié)果與分析

2.1 核桃仁蛋白酶水解物對(duì)MCF-7 細(xì)胞增殖影響

用含核桃仁蛋白酶水解物(0.5、1、2、3 和4mg/mL)的細(xì)胞培養(yǎng)基，孵育MCF-7 細(xì)胞48h，通過MTT細(xì)胞增殖分析試驗(yàn)研究對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)的影響，結(jié)果顯示明顯的生長(zhǎng)抑制作用，呈一定的劑量依賴性。核桃仁蛋白酶水解物的濃度為0.5mg/mL 和1mg/mL 時(shí)未顯示明顯的增殖抑制作用;當(dāng)濃度為2mg/mL 及以上時(shí)，細(xì)胞增殖抑制作用極為顯著(P ＜0.001)，能夠抑制80%的細(xì)胞增殖。核桃仁蛋白酶水解物抑制細(xì)胞生長(zhǎng)率為50%所需作用物濃度，即IC50 值為1.62mg/mL。然而，高濃度的核桃蛋白(4mg/mL)也未顯示出細(xì)胞增殖抑制作用(圖1)。結(jié)果表明，核桃仁蛋白被木瓜酶水解后，產(chǎn)生了抑制MCF-7 細(xì)胞增殖的活性成分-活性肽。

圖1 核桃仁蛋白酶水解物對(duì)MCF-7 細(xì)胞增殖的影響

2.2 不同分子量核桃仁蛋白酶水解物對(duì)MCF-7 細(xì)胞增殖抑制作用比較

具有生物活性的肽類一般為小分子肽，如具有抗腫瘤活性的大豆多肽［9］、具有抗氧化活性的金絲小棗多肽［14］和鷹嘴豆肽［15］。為了研究核桃仁蛋白酶水解物中，抑制MCF-7 細(xì)胞增殖作用的活性成分，將核桃仁蛋白酶水解物，通過不同截留分子量的超濾膜，分離為10kDa＞MW ＞5kDa、5kDa ＞MW ＞3kDa 和MW ＜3kDa 等3 個(gè)不同組分。在0.5、1、2、3、4mg/mL 濃度水平，用MTT 法檢測(cè)不同組分對(duì)MCF-7 細(xì)胞增殖的影響，結(jié)果表明，10kDa ＞MW ＞5kDa、5kDa ＞MW ＞3kDa 和MW ＜3kDa 三個(gè)組分的半數(shù)抑制濃度IC50 值，分別為4.206、6.285、2.382mg/mL (圖2)。MW ＜3kDa 組分的細(xì)胞增殖抑制作用，較10kDa ＞MW ＞5kDa 和5kDa ＞MW ＞3kDa 組分顯著，表明抑制MCF-7 細(xì)胞增殖的活性成分，主要存在于MW ＜3kDa 小分子量組分中。10kDa ＞MW＞5kDa 組分的作用較5kDa ＞MW ＞3kDa 組分強(qiáng)，表明該組分中也含有活性肽，因水解不徹底而沒有完全被釋放。無論是哪一種組分，其活性均低于總酶解物，提示核桃仁蛋白酶水解物的細(xì)胞增殖抑制作用，需要各種肽之間的協(xié)同作用。

圖2 不同分子量的核桃仁蛋白酶水解物對(duì)MCF-7 細(xì)胞增殖的影響

2.3 低分子量核桃仁蛋白酶水解物的氨基酸含量分析

氨基酸的含量及組成對(duì)多肽的生物活性起關(guān)鍵性作用［16］，例如，含有色氨酸和酪氨酸的三肽化合物具有很強(qiáng)的清除自由基的活性［17］，含極性氨基酸殘基和疏水性氨基酸殘基的肽段具有抗腫瘤活性［18］。附表顯示，抑制MCF-7 細(xì)胞增殖活性較高的MW ＜3kDa 組分中，疏水性氨基酸Ala、Val、Met、Leu、Phe、Trp 含量均高于3kDa ＜MW ＜5kD 和5kDa ＜MW ＜10kDa 組分。疏水性氨基酸可提高多肽的脂溶性，從而具有更高的生物活性［19］。MW ＜3kDa 組分中，芳香族氨基酸Phe、Tyr 含量均有增加，中性極性氨基酸Gly、Ser、Tyr 含量均高于其他組分。MW ＜3kDa 組分中，Arg 含量高于其他組分(一定劑量的精氨酸對(duì)腫瘤生長(zhǎng)有抑制作用［20］)。本項(xiàng)研究通過以上分析認(rèn)為，具有較高抑制癌細(xì)胞增殖作用的低分子量核桃仁蛋白酶水解物中，疏水性氨基酸、中性氨基酸、芳香族氨基酸及精氨酸含量較高。

附表 不同分子量的核桃仁蛋白酶水解物的氨基酸含量檢測(cè)結(jié)果(%)

3 結(jié)論

核桃仁蛋白對(duì)人乳腺癌細(xì)胞MCF-7 細(xì)胞增殖，沒有顯示抑制作用，然而被木瓜酶水解后顯示非常強(qiáng)烈的細(xì)胞增殖抑制作用。該結(jié)果表明，核桃仁蛋白中含有抑制癌細(xì)胞生長(zhǎng)的生物活性肽，該活性肽經(jīng)木瓜酶水解而被釋放并顯示其生物學(xué)作用。在蛋白酶水解物中，肽的分子量與生物活性具有密切關(guān)系。為研究該活性肽的特點(diǎn)，將多肽按分子量大小分為不同組分，研究其抑制癌細(xì)胞生長(zhǎng)的作用。結(jié)果表明，MW ＜3kDa 的低分子量的組分，具有較高的抑制癌細(xì)胞增殖作用，表明活性成分為分子量小于3kDa。進(jìn)一步研究MW ＜3kDa 組分的氨基酸含量，發(fā)現(xiàn)疏水性氨基酸、芳香族氨基酸和中性極性氨基酸含量較其他組分增加。本項(xiàng)研究結(jié)果為解明核桃仁蛋白酶水解物抗腫瘤作用活性成分提供重要的科學(xué)依據(jù)，為核桃仁蛋白的科學(xué)有效利用具有重要意義。

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