馮亮群

(河南省洛陽(yáng)市婦女兒童醫(yī)療保健中心麻醉科，河南 洛陽(yáng) 471000)

內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激在羅哌卡因誘導(dǎo)SH-SY5Y細(xì)胞凋亡中的作用

馮亮群

(河南省洛陽(yáng)市婦女兒童醫(yī)療保健中心麻醉科，河南 洛陽(yáng) 471000)

目的 探討內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激在羅哌卡因誘導(dǎo)SH-SY5Y細(xì)胞凋亡中的作用。方法 羅哌卡因組采用3 mmol／L羅哌卡因處理SH-SY5Y細(xì)胞，阻斷組采用10 mol／L SB203580及3 mmol／L羅哌卡因處理SH-SY5Y細(xì)胞。分析各組細(xì)胞增殖活性、凋亡，活性氧簇（ROS）及p38MAPK水平。結(jié)果 與對(duì)照組比較，細(xì)胞存活率羅哌卡因組顯著降低（t=5.29，P＜0.05），阻斷組較羅哌卡因組顯著升高，但顯著低于對(duì)照組（t=3.18，t=4.96，P＜0.05）；羅哌卡因組細(xì)胞凋亡率較對(duì)照組及阻斷組顯著升高（F=125.16，P＜0.05）；羅哌卡因組細(xì)胞內(nèi)的ROS水平顯著升高（P＜0.05），阻斷組ROS水平較對(duì)照組高（P＜0.05）但顯著低于羅哌卡因組（P＜0.05）；各組p38MAPK水平差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），羅哌卡因組p-p38MAPK顯著升高，阻斷后表達(dá)水平降低（P＜0.05）。結(jié)論 羅哌卡因處理SH-SY5Y細(xì)胞能誘發(fā)細(xì)胞內(nèi)ROS的蓄積，抑制細(xì)胞增殖活性，促進(jìn)凋亡，p38MAPK通路的激活在誘導(dǎo)凋亡的過(guò)程中有重要作用。

活性氧簇；羅哌卡因；SH-SY5Y；細(xì)胞凋亡

隨著局部麻醉藥（簡(jiǎn)稱(chēng)局麻藥）在椎管內(nèi)麻醉的廣泛應(yīng)用，其安全性及可能存在的神經(jīng)毒性越來(lái)越引起學(xué)者的關(guān)注[1]。局麻藥的神經(jīng)毒性主要表現(xiàn)以神經(jīng)纖維或脊髓初級(jí)神經(jīng)元的損傷為主，包括暫時(shí)性神經(jīng)病學(xué)綜合征（transient neurological syndrome，TNS）[2]及馬尾神經(jīng)綜合征（cauda equine syndrome，CES）[3]。局麻藥用于椎管內(nèi)或區(qū)域神經(jīng)阻滯，可直接作用于神經(jīng)元，破壞其氧化磷酸化，干擾線粒體跨膜電位[4]，促進(jìn)神經(jīng)元程序性死亡。多項(xiàng)研究表明，羅哌卡因能觸發(fā)神經(jīng)元細(xì)胞內(nèi)活性氧簇（ROS）暴發(fā)，在神經(jīng)毒性機(jī)制中有重要的作用[5]。筆者分析了p38MAPK途徑在羅哌卡因誘導(dǎo)SH-SY5Y細(xì)胞凋亡中的作用，為預(yù)防臨床羅哌卡因引起的神經(jīng)毒性及開(kāi)發(fā)有效的治療藥物提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

DMEM／F12培養(yǎng)基、FBS（Gibco公司）；鹽酸羅哌卡因（AstraZeneca公司）；細(xì)胞凋亡試劑盒、噻唑藍(lán)(MTT)、p38MAPK、p-p38MAPK及 GAPDH抗體（Abcam公司）；SH-SY5Y細(xì)胞株（中科院上海生命科學(xué)研究院細(xì)胞資源中心）。

1.2 方法

細(xì)胞培養(yǎng)復(fù)蘇：置SH-SY5Y細(xì)胞株于含有15%FBS、青霉素100 U／mL、鏈霉素100 μg／mL的DMED／F12培養(yǎng)基，于37℃及5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2 d，細(xì)胞貼壁后分組處理細(xì)胞。將SH-SY5Y細(xì)胞隨機(jī)分為3組，即對(duì)照組（無(wú)血清培養(yǎng)基培養(yǎng)30 h），羅哌卡因組（3 mmol／L羅哌卡因＜國(guó)藥準(zhǔn)字H20050325，廣東華潤(rùn)順?lè)逅帢I(yè)有限公司＞），無(wú)血清培養(yǎng)基培養(yǎng)30 h）及阻斷組（3 mmol／L羅哌卡因+10 μmol／L SB203580，無(wú)血清培養(yǎng)基培養(yǎng)30 h）。

細(xì)胞內(nèi)ROS檢測(cè)：將各組細(xì)胞培養(yǎng)液用胰酶消化細(xì)胞后，按1∶1 000用磷酸鹽緩沖液(PBS)稀釋熒光探針DCFH-DA，按終濃度10 μL／L加入DCFH-DA于培養(yǎng)液中，37℃培養(yǎng)箱中孵育20 min，用 PBS洗去多余未進(jìn)入細(xì)胞的DCFH-DA，制成單細(xì)胞懸液。以激發(fā)光波長(zhǎng)488 nm、發(fā)射波長(zhǎng)524 nm、FCM檢測(cè)各組細(xì)胞內(nèi)熒光強(qiáng)度。

MTT法檢測(cè)細(xì)胞存活率：收集各組細(xì)胞，調(diào)節(jié)細(xì)胞懸液濃度至1×106／mL。每孔加入MTT溶液10 μL，繼續(xù)培養(yǎng)4 h。1 000 r／min離心10 min，棄上清液，每孔加入DMSO 100 μL，置搖床上低速振蕩10 min，使結(jié)晶物充分溶解。在酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀 OD570（630 nm校準(zhǔn)）測(cè)量各孔的 OD值。增殖抑制率=（1-OD試驗(yàn)組／OD對(duì)照組）× 100%。

流式細(xì)胞術(shù)測(cè)定細(xì)胞凋亡情況：收集細(xì)胞，用100 μL的標(biāo)記溶液重懸細(xì)胞，室溫下避光孵育10～15 min。500～1 000 r／min離心5 min，沉淀細(xì)胞，孵育，緩沖液洗1次。加入熒光（SA-FLOUS）溶液4℃下孵育20 min，避光并不時(shí)振動(dòng)。流式細(xì)胞儀激發(fā)光波長(zhǎng)用488 nm，用一波長(zhǎng)為515 nm的通帶濾器檢測(cè)FITC熒光，另一波長(zhǎng)為560 nm的濾器檢測(cè)PI。

Western bolt法分析細(xì)胞p38MAPK等蛋白表達(dá)水平：加200 μL裂解液（50 mmol／L Tris-HCl pH 8.0，150 mmol／L PMSF，0.1% NP-40，蛋白酶抑制劑），4℃12 000 r／min離心15 min，取上清液，采用Bradford法檢測(cè)蛋白濃度。取上述制備的蛋白樣品50 μg，上樣到15%SDS-PAGE凝膠，電泳完畢后將蛋白電轉(zhuǎn)至NC膜，用5%脫脂奶粉封閉，分別加一抗，37℃孵育2 h，經(jīng)0.1%TBST漂洗后加二抗（1∶2 000），室溫孵育2 h，TBST洗膜后加ECL，X線膠片定影，掃描后用IPP 6.0進(jìn)行圖像分析。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 對(duì)SH-SY5Y細(xì)胞增殖的抑制作用

MTT檢測(cè)顯示，與對(duì)照組比較，羅哌卡因組細(xì)胞存活率顯著降低（t=5.29，P＜0.05），阻斷組細(xì)胞存活率較羅哌卡因組顯著升高，但顯著低于對(duì)照組（t=3.18，t=4.96，P＜0.05），見(jiàn)圖1。

圖1 MTT檢測(cè)各組細(xì)胞增殖活性

2.2 對(duì)SH-SY5Y細(xì)胞凋亡的影響

采用流式細(xì)胞術(shù)Annecxin-FITC／PI雙染檢測(cè)各組SH-SY5Y細(xì)胞凋亡率，結(jié)果顯示，羅哌卡因組細(xì)胞凋亡率為(37.15± 7.02)%，較對(duì)照組的(5.16±1.25)%及阻斷組的(14.91±5.11)%顯著升高（F=125.16，P＜0.05）。

2.3 對(duì)SH-SY5Y細(xì)胞ROS及p-p38MAPK的影響

與對(duì)照組比較，羅哌卡因組細(xì)胞內(nèi)的ROS水平顯著升高（P＜0.05），阻斷組升高（P＜0.05）但顯著低于羅哌卡因組（P＜0.05），見(jiàn)圖 2。p38-MAPK在各組間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），但在羅哌卡因組，p-p38MAPK顯著升高，阻斷后表達(dá)水平降低（P＜0.05），見(jiàn)圖3。

圖2 各組細(xì)胞內(nèi)ROS水平

圖3 Western blot法分析各組p38MAPK表達(dá)水平

3 討論

羅哌卡因的結(jié)構(gòu)特征和藥理特性與布比卡因類(lèi)似，但心血管和中樞神經(jīng)系統(tǒng)毒性均較布比卡因低[6]，廣泛應(yīng)用于蛛網(wǎng)膜下腔阻滯麻醉，具有低濃度時(shí)感覺(jué)-運(yùn)動(dòng)神經(jīng)分離現(xiàn)象突出的優(yōu)點(diǎn)[7]。相同濃度、劑量的羅哌卡因和布比卡因用于蛛網(wǎng)膜下腔阻滯時(shí)，運(yùn)動(dòng)神經(jīng)阻滯起效時(shí)間羅哌卡因慢且弱[8]。羅哌卡因能可逆地減少神經(jīng)纖維膜對(duì)鈉離子的通透性，減慢去極化的速度，提高應(yīng)激閾值，優(yōu)先阻滯感覺(jué)纖維，使運(yùn)動(dòng)神經(jīng)纖維輕微阻滯。但由于羅哌卡因與血漿蛋白結(jié)合率低，脂溶性差，對(duì)神經(jīng)膜、神經(jīng)鞘膜及血腦屏障的穿透弱、蓄積能力差[9]。

過(guò)氧化物、DNA損傷及鈣離子自穩(wěn)態(tài)等因素均能誘導(dǎo)神經(jīng)細(xì)胞凋亡，神經(jīng)細(xì)胞在進(jìn)入 DNA降解前，線粒體功能發(fā)生紊亂，內(nèi)膜跨膜電位消失，激活凋亡相關(guān)代謝改變[10]。ROS暴發(fā)是導(dǎo)致神經(jīng)細(xì)胞急性損傷的主要因素之一，其在細(xì)胞內(nèi)累積，破壞細(xì)胞內(nèi)氧化還原的動(dòng)態(tài)平衡，損傷線粒體膜，還可與核酸、蛋白直接發(fā)生作用使其功能發(fā)生抑制。研究顯示，p38MAPK途徑在神經(jīng)細(xì)胞凋亡中有重要作用[11]。本研究中采用羅哌卡因處理SH-SY5Y細(xì)胞，結(jié)果顯示，細(xì)胞內(nèi)的ROS水平顯著升高，細(xì)胞的增殖活性降低，凋亡率升高；經(jīng)p38MAPK阻斷劑SB203580阻斷后，細(xì)胞的增殖活性及凋亡率均較羅哌卡因處理組顯著改善。由圖3可知，各組間p38MAPK的表達(dá)無(wú)顯著性差異，但磷酸化的p38MAPK的表達(dá)差異顯著，p-p38MAPK是其活化形式，其表達(dá)升高提示p38MAPK通路的激活。神經(jīng)細(xì)胞損傷時(shí)存在ROS的蓄積[12]，如羥自由基、超氧陰離子等造成神經(jīng)組織氧化應(yīng)激狀態(tài)[13]，參與神經(jīng)損傷的發(fā)生發(fā)展。ROS作為第二信使，激活包括MAPK在內(nèi)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，使絲氨酸／蘇氨酸激酶信號(hào)級(jí)聯(lián)活化，造成神經(jīng)細(xì)胞損傷。

綜上所述，羅哌卡因處理SH-SY5Y細(xì)胞能誘發(fā)細(xì)胞內(nèi)ROS的蓄積，抑制細(xì)胞增殖活性，促進(jìn)凋亡，且p38MAPK通路的激活在誘導(dǎo)凋亡的過(guò)程中有重要的作用。

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The Role of Endoplasmic Reticulum Stress in Ropivacaine Inducing SH-SY5Y Cell Apoptosis

Feng Liangqun
(Anesthesiology Department,Luoyang Women and Children Health Care Center,Luoyang,Henan,China 471000)

Objective To analyse the role of endoplasmic reticulum stress in ropivacaine inducing SH-SY5Y cell apoptosis.M ethods The ropivacaine group was given 3 mmol／L ropivacaine to treat SH-SY5Y cells，the blocking group was given 10 μmol／L SB203580 and 3 mmol／L ropivacaine.Cell proliferation，apoptosis，ROS and p38MAPK levels were analyzed.Results Compared with the control group，the cell survival rate of the ropivacaine group after treatment was significantly reduced(t=5.29，P＜0.05)，the cell survival rate of the blocking group was significantly higher than the ropivacaine group，but significantly lower than the control group(t=3.18，t=4.96，P＜0.05);apoptosis rate in the ropivacaine group was higher than the control group and the blocking group(F=125.16，P＜0.05); The ROS levels in ropivacaine group were significantly increased(P＜0.05)，ROS levels in blocking group was higher than the control group(P＜0.05)，but significantly lower than the ropivacaine group(P＜0.05);the difference of p38MAPK in each group has no statistical significance(P＞0.05)，but p-p38MAPK was significantly higher in the ropivacaine group and the level of which in the blocking group deceased(P＜0.05).Conclusions Ropivacaine in treating SH-SY5Y cells can induce intracellular ROS accumulation, inhibit cell proliferation，induce apoptosis，and plays an important role in activating p38MAPK pathway.

ROS;ropivacaine;SH-SY5Y;cell apoptosis

R965；R971+.2

A

1006-4931(2015)17-0013-03

馮亮群（1968-），女，大學(xué)本科，副主任醫(yī)師，主要從事臨床麻醉工作，（電子信箱）flq_681122＠163.com。

2015-03-13)