劉劍鋒 朱平 馬守原 陳海旭 王曙霞 李珊

·基礎(chǔ)研究·

姜黃素通過血紅素加氧酶-1信號通路促進脂肪源干細胞增殖和旁分泌研究

劉劍鋒 朱平 馬守原 陳海旭 王曙霞 李珊

目的 探討姜黃素對脂肪源干細胞(ADSCs)增殖和旁分泌的作用及其機制。方法酶法分離、擴增SD大鼠腹股溝的ADSCs，流式細胞儀檢測細胞表型；MTT法檢測不同濃度姜黃素對細胞生長曲線的影響，篩選最佳姜黃素處理濃度；姜黃素預處理ADSCs 24 h，加用血紅素加氧酶-1(HO-1)抑制劑SnPP阻斷HO-1活性；qPCR和Western blot檢測HO-1信號在姜黃素處理ADSCs過程中的變化；MTT法檢測HO-1活性對姜黃素促進細胞增殖的影響；PCR和Elisa法分別檢測姜黃素對ADSCs分泌VEGF和HGF的影響。結(jié)果 第3代ADSCs的CD29、CD90陽性，CD31、CD34、CD45陰性。姜黃素促進ADSCs增殖的作用呈時間依賴性，最佳處理濃度為10 μmol/L。加用SnPP后，促增殖作用顯著降低(P=0.001)。姜黃素能顯著促進ADSCs分泌VEGF和HGF(分別為P=0.001和P=0.007)，SnPP能明顯抑制姜黃素的促分泌作用[Cur-ADSCs比Cur-ADSCs+SnPP：VEGF為(712.2±43.1)ng/L比(442.3±33.2)ng/L，P=0.001；HGF為(58.3±3.7)ng/L比(33.7±3.1)ng/L，P=0.001]。在此過程中，HO-1表達的變化方向和姜黃素促進ADSCs增殖和旁分泌的方向一致。結(jié)論HO-1介導了姜黃素促進ADSCs增殖和旁分泌的作用。姜黃素是一種有前景的增強干細胞治療療效的候選藥物。

姜黃素； 血紅素加氧酶-1； 脂肪干細胞； 細胞增殖； 旁分泌

干細胞是心臟再生研究的熱點之一。脂肪間充質(zhì)干細胞(adipose-derived stem cells，ADSCs)具有來源豐富、取材方便、易培養(yǎng)擴增、潛在的向心肌自發(fā)分化等優(yōu)點，并且與骨髓間充質(zhì)干細胞具有相似的性質(zhì)，日益受到青睞，廣泛應用于基礎(chǔ)與臨床研究。然而，ADSCs的數(shù)量及旁分泌功能嚴重影響其功能發(fā)揮。因此，亟須開發(fā)新的方法和策略增加ADSCs的數(shù)量及其旁分泌功能。

姜黃素(curcumin)是從姜科姜黃屬植物姜黃根莖中提取的一種酚性色素，具有強大的抗炎、抗氧化作用，能刺激胚胎神經(jīng)祖細胞的增殖[1]。而且，姜黃素能誘導ADSCs中血紅素氧合酶-1(heme oxygenase-1，HO-1)的表達，降低ADSCs的氧化應激損傷[2]。雖然HO-1的高表達促進骨髓間充質(zhì)干細胞的增殖與旁分泌[3]，但姜黃素能否通過上調(diào)HO-1表達促進ADSCs的增殖和旁分泌尚未見報道。本研究擬通過探索姜黃素對ADSCs增殖能力的影響，結(jié)合HO-1抑制劑，探討姜黃素促進ADSCs增殖和旁分泌的作用機制，為ADSCs移植治療心肌梗死提供新策略。

1 材料與方法

1.1 動物和藥物準備

選取60～80 g雌性SD大鼠(3～4周齡)，實驗步驟依據(jù)美國國立衛(wèi)生研究院(NIH)2011年公布的實驗動物管理及使用指南(第8版)，并獲得解放軍總醫(yī)院的動物倫理委員會(IACUC)批準。姜黃素源自Biomol 公司(AG-CN2-0059-M010，美國)。

1.2 ADSCs的分離、培養(yǎng)、鑒定

1.2.1 ADSCs的分離、培養(yǎng) 將SD大鼠麻醉并斷頸處死，無菌條件下取出腹股溝處脂肪組織，經(jīng)PBS洗滌、剪碎，Ⅳ型膠原酶和胰酶消化后，勻速攪拌1 h，經(jīng)中和、過濾、離心、棄上清、重懸等步驟后，將細胞懸液(1×106/ml)接種至10 cm培養(yǎng)皿中，添加10% α-MEM培養(yǎng)基，待細胞生長至70%～80%匯合時，消化、收集貼壁的細胞(原代細胞，P0)，以1∶3的比例進行傳代。本實驗中使用的細胞均為第3代(P3)。貼壁培養(yǎng)24 h后使用普通光學顯微鏡(SZ51，日本Olympus公司)進行細胞形態(tài)觀察。

1.2.2 流式細胞儀表型鑒定 取P3的ADSCs，以1×106細胞/ml懸液的密度，分裝至1.5 ml的Eppendoff離心管中，以細胞染色緩沖液(Cell Staining Buffer，美國Biolegend公司)洗滌2次后，根據(jù)CD34、CD31、CD45、CD90和CD29的抗體說明書，加入適量抗體，37℃暗室孵育30 min，再次以細胞染色緩沖液洗滌，最后每管加入1 ml細胞染色緩沖液重懸細胞，進行流式細胞儀(美國BD accrri C6)檢測。

1.3 ADSCs的活性檢測

ADSCs以3 000細胞/孔接種于96孔板中，分別給予0、1、5、10和20 μmol/L姜黃素處理24 h，采用MTT法在第1、3、5和7天進行檢測。檢測前將培養(yǎng)基移除，加入20 μl MTT液(5 mg/ml)，37℃避光孵育4 h，移除培養(yǎng)液后加入200 μl DMSO，搖晃震蕩15 min后應用酶標儀檢測490 nm的吸光度值(D490)，每種濃度設置3個復孔，均重復5次。最后將所得數(shù)值繪制為生長曲線。

1.4 實驗分組

將ADSCs以1×106細胞/皿接種到10 cm培養(yǎng)皿中6 h后，細胞分為4組：ADSCs、ADSCs+SnPP、Cur-ADSCs、Cur-ADSCs+SnPP。SnPP是HO-1抑制劑，濃度采用50 μmol/L[4]，預處理ADSCs 24 h后，PBS漂洗3次，再用促生長的姜黃素最佳濃度貼壁培養(yǎng)24 h。

1.5 實時定量聚合酶鏈反應(qPCR)檢測旁分泌因子的mRNA水平

PBS洗滌2遍，以細胞刮收集ADSCs，提取總RNA，反轉(zhuǎn)錄cDNA，每組至少3個樣本，檢測以下基因：β-actin(內(nèi)參)、肝細胞生長因子(hepatocyte growth factor，HGF)、血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)和HO-1。qPCR使用FastStart Universal SYBR Green Master和StepOnePLUS System檢測。由3名獨立的實驗人員分析。所有引物由Primer 5.0軟件設計，引物序列如表1。

表1 qPCR檢測的引物序列

1.6 Elisa法檢測ADSCs分泌的VEGF和HGF濃度

ADSCs在有或無姜黃素條件下貼壁培養(yǎng)24 h后，按照Elisa檢測盒(VEGF，美國Sigma Aldrich公司；HGF，美國B-Bridge公司)的說明書要求，收集ADSCs上清液。根據(jù)不同濃度標準品的標準曲線，計算上清液中的樣品濃度。

1.7 Western blot檢測ADSCs的HO-1表達

將裂解收集的ADSCs樣本，低溫快速勻漿、離心，使用BCATM法測定蛋白濃度。將制備好的12%十二烷基磺酸鈉凝膠，灌注于電泳板梳孔中，凝固后經(jīng)洗滌、二抗孵育、棄封閉液、再次洗滌等步驟，檢測PVDF膜上的蛋白條帶。HO-1抗體源自美國Cell Signaling公司。通過蛋白條帶的平均光密度來比較蛋白表達情況。

1.8 統(tǒng)計學方法

2 結(jié)果

2.1 ADSCs的形態(tài)及表型鑒定

原代(P0)和第3代(P3)ADSCs貼壁24 h后形態(tài)均為梭形、成纖維樣(圖1A)。此外，傳代到P3后，大部分ADSCs的間充質(zhì)免疫標志CD29和CD90表達為陽性，而造血細胞標志CD34和CD45均呈陰性。而且，血管內(nèi)皮細胞標記CD31的表達也是陰性(圖1B)。結(jié)果表明，分離的細胞符合ADSCs的表型特征。

2.2 姜黃素對ADSCs活性的影響

不同濃度(0、1、5、10和20 μmol/L)姜黃素對ADSCs的促增殖作用在處理第1、3、5和7天時呈時間依賴性增強(均為P<0.05)。但是，第5天開始，20 μmol/L姜黃素對ADSCs的促增殖作用開始弱于10 μmol/L姜黃素的作用(圖2)。提示10 μmol/L姜黃素的促增殖效果最佳，增強ADSCs的活性最好。

A：原代(P0)和第三代(P3)ADSCs形態(tài)；B：第3代(P3)ADSCs表型的流式鑒定

圖2 不同濃度姜黃素對ADSCs生長曲線的影響

2.3 姜黃素對HO-1信號的影響

qPCR結(jié)果表明，姜黃素能顯著上調(diào)HO-1的mRNA，但這種增強作用能被SnPP明顯抑制(P=0.001)。對于單純ADSCs，mRNA表達水平在加入SnPP組和未加入SnPP組之間無明顯差異(圖3A)。在此基礎(chǔ)上，我們檢測了HO-1蛋白的表達水平。Western blot結(jié)果印證了上述qPCR結(jié)果，即姜黃素能顯著提高HO-1的表達，而這種增強作用能被SnPP明顯削弱(圖3B)。上述結(jié)果提示姜黃素可能通過激活HO-1信號發(fā)揮作用。

A：姜黃素對HO-1 mRNA的影響；B：姜黃素對HO-1蛋白的影響。與ADSCs組相比，aP<0.05；與Cur-ADSCs組相比，bP<0.05

2.4 HO-1介導姜黃素對ADSCs的促增殖作用

MTT結(jié)果顯示，姜黃素明顯促進ADSCs的增殖，但這種促增殖作用被SnPP顯著削弱(P=0.001)，導致與未處理ADSCs組相比無明顯差異(圖4)。提示姜黃素對ADSCs的促增殖作用是通過HO-1介導的。

與ADSCs組相比，aP<0.05；與Cur-ADSCs組相比，bP<0.05

與ADSCs組相比，aP<0.05；與Cur-ADSCs組相比，bP<0.05

2.5 HO-1介導姜黃素對ADSCs的促旁分泌作用

qPCR結(jié)果顯示，姜黃素顯著增強ADSCs的VEGF mRNA和HGF mRNA表達水平。而SnPP的加入抑制了ADSCs的VEGF和HGF mRNA表達水平(圖5)。為了更準確描述姜黃素的促旁分泌作用，Elisa結(jié)果顯示，姜黃素能促進ADSCs分泌VEGF和HGF，而SnPP抑制ADSCs的VEGF和HGF分泌量(圖6)。這些均表明，HO-1在姜黃素促進ADSCs旁分泌過程中發(fā)揮了重要作用。

與ADSCs組相比，aP<0.05；與Cur-ADSCs組相比，bP<0.05

3 討論

ADSCs在組織再生研究中具有巨大應用前景。干細胞的增殖能力對于其活性至關(guān)重要，能明顯影響干細胞移植后的存活。此外，近年研究報道，干細胞的旁分泌作用是干細胞移植治療心肌梗死的重要機制。作為旁分泌因子，VEGF和HGF能誘導內(nèi)皮細胞和血管平滑肌細胞遷移、增殖以及血管形成[5]。鑒于心肌缺血缺氧條件下，干細胞活性下降，旁分泌功能降低，因此促進干細胞存活、進而增強其旁分泌功能是提高干細胞移植療效的重要策略。Hsiao等[6]證實，低氧預適應顯著增強ADSCs的血管生成和旁分泌能力。Hou等[3]應用膠原蛋白復合HO-1處理MSCs，發(fā)現(xiàn)MSCs的旁分泌功能明顯增加，顯著促進糖尿病缺血性潰瘍的治療。而且，研究者本人2014年應用Exendin-4預處理ADSCs后發(fā)現(xiàn)，ADSCs經(jīng)藥物處理后的旁分泌因子顯著增多，有效促進缺血心肌的修復[7]。姜黃素能影響多種細胞的增殖、分化和旁分泌功能。據(jù)報道，姜黃素對癌癥細胞有抗增殖作用[8]。與之相反，另有研究表明，姜黃素能促進胚胎神經(jīng)祖細胞的增殖[1]。但姜黃素對ADSCs的增殖及旁分泌影響均尚未見報道。

本研究發(fā)現(xiàn)，姜黃素對ADSCs的促增殖作用呈濃度依賴性，10 μmol/L姜黃素對ADSCs的促增殖效力最大，且能顯著促進ADSCs分泌VEGF和HGF。因此，姜黃素是ADSCs移植治療疾病的一種有效候選輔助方法。HO-1是血紅素加氧酶的誘導型，能將血紅素代謝為CO、鐵離子和膽綠素、膽紅素。據(jù)報道，作為一種抗氧化代謝關(guān)鍵酶，HO-1上調(diào)能保護干細胞免受氧化應激損傷、促進MSCs增殖及旁分泌并促進血管形成[3, 9]。HO-1下調(diào)降低干細胞和祖細胞對急性應激的反應[10]。與上述實驗結(jié)果相似，本研究結(jié)果顯示HO-1在姜黃素促進ADSCs的增殖和旁分泌過程中發(fā)揮重要作用，是一種關(guān)鍵調(diào)控信號。

綜上所述，本研究證實姜黃素改善ADSCs活性的最佳濃度是10 μmol/L；姜黃素能顯著促進ADSCs的增殖和旁分泌功能；在此過程中，HO-1發(fā)揮了至關(guān)重要作用。作為一種預處理策略，姜黃素能顯著增強ADSCs的增殖和旁分泌作用，而HO-1介導了整個過程。

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(本文編輯：譚瀟)

Curcumin promotes the proliferation and paracrine of ADSCs via HO-1 Pathway

LiuJianfeng1,ZhuPing1,MaShouyuan1,ChenHaixu2,WangShuxia1,LiShan1.

1DepartmentofGeriatricCardiology,ChinesePLAGeneralHospital,Beijing100853; 2InstituteofGeriatrics

ZhuPing,Email:shenlangliu@163.com

Objective To explore the effects and mechanism of curcumin on the proliferation and paracrine of adipose-derived stem cells (ADSCs). Methods ADSCs were isolated through enzymes from SD rats inguina. The phenotypes of ADSCs were analyzed by flow cytometry. The effects of different concentrations of curcumin on cell growth curve were determined through MTT. Following by pretreatment of curcumin on ADSCs for 24 h, the SnPP, an inhibitor of heme oxygenase-1 (HO-1), was added to suppress HO-1 activity. PCR and western blotting was used to assess the changes of HO-1 expression during the curcumin treatment. The effects of HO-1 expression on the curcumin promoting proliferation by MTT. qPCR and Elisa were applied to investigate the influences of curcumin on the secretion of VEGF and HGF. ResultsAfter three passages, most of adherent ADSCs expressed CD29 and CD90. But they were negative for CD31, CD34 and CD45. The promoting proliferation of curcumin on ADSCs depended on time. The optimal treatment concentration of curcumin was 10 μmol/L. After added SnPP, the increased proliferation of ADSCs by curcumn pretreatment decreased significantly (P=0.001). And the enhancing VEGF and HGF secreted by curcumin pretreated ADSCs (P=0.001 andP=0.007, respectively) were reduced by treatment of SnPP [Cur-ADSCsvs. Cur-ADSCs+SnPP: VEGF: (712.2±43.1) ng/Lvs. (442.3±33.2) ng/L，P=0.001；HGF: (58.3±3.7) ng/Lvs. (33.7±3.1) ng/L，P=0.001]. Importantly, the change trend of HO-1 was parallel with the promoting proliferation and paracrine of ADSCs by pretreatment of curcumin. Conclusions Curcumin promotes the proliferation and paracrine of ADSCs partly via HO-1 signaling pathway. Curcumin is a promising candidate drug for enhancing the therapeutic effects of stem cells.

Curcumin； Heme oxygenase-1； Adipose-derived stem cells； Cell proliferation； Paracrine

10.3969/j.issn.1007-5410.2015.03.010

國家自然科學基金主任基金(8135002)；解放軍總醫(yī)院臨床扶持基金(2013FC-TSYS-2015)

100853 北京，解放軍總醫(yī)院南樓心內(nèi)科(劉劍鋒、朱平、馬守原、王曙霞、李珊)，老年醫(yī)學研究所(陳海旭)

朱平，電子信箱：shenlangliu@163.com

2015-03-31)

ThisworkwassupportedbythegrantsfromNationalNaturalScienceFoundationofChina(No. 8135002)andClinicalSupportFoundationofChinesePLAGeneralHospital(No. 2013FC-TSYS-2015).