郭文杰，陳 焱，王躍锜，蔡佩玲

（1.成都大學(xué)醫(yī)護(hù)學(xué)院解剖教研室，成都610106；2.四川大學(xué)第二附屬醫(yī)院生殖內(nèi)分泌科，成都610000）

順鉑具有腎毒性、耳毒性、神經(jīng)毒性和骨髓抑制等多種不良反應(yīng)［1］，尤其易造成神經(jīng)性耳聾，使用順鉑進(jìn)行化療的患者75%～100%會(huì)發(fā)生不同程度的聽力損失［2］，因而限制了其臨床抗腫瘤的廣泛使用。研究顯示順鉑造成的耳毒性與過量的氧自由基有關(guān)［3］，可誘導(dǎo)耳蝸細(xì)胞凋亡［4］，主要在Corti器、螺旋神經(jīng)節(jié)、血管紋［5］。目前，順鉑耳毒性防治主要使用抗氧化劑［6］、抗凋亡劑進(jìn)行治療［7］。二十二碳六烯酸（docosahexaenoic acid，DHA）是n-3系列多不飽和脂肪酸（n-3polyunsaturated fatty acids，n-3PUFA），具有抗炎、抗氧化作用［8］，抑制血栓形成、降低血黏度等作用［9］?；陧樸K的臨床耳毒性、動(dòng)物實(shí)驗(yàn)毒理及DHA 在細(xì)胞抗氧化、抗炎、改善血液流變學(xué)等方面的研究證據(jù)，本實(shí)驗(yàn)以豚鼠為實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，觀察DHA 灌胃給藥對順鉑所致耳蝸損傷的干預(yù)作用，為順鉑化療并發(fā)癥的臨床防治提供基礎(chǔ)研究參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑 健康豚鼠24只（成都達(dá)碩生物科技有限公司提供），體質(zhì)量250～350g，均為雄性，檢查均耳廓反應(yīng)靈敏，外耳道無炎癥異物。ABR 檢測儀（BQ603EP15 公司，丹麥）。光學(xué)顯微鏡（奧林巴斯BX53，日本），切片機(jī)（Leica RM2245），解剖顯微鏡（舜宇ST-60 20X-40X）。順鉑（江蘇豪森藥業(yè)），75%DHA（山東榮成百合生物技術(shù)公司），硝酸銀（重慶川東化工有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物處理 動(dòng)物適應(yīng)性喂養(yǎng)5d后進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，隨機(jī)分為正常對照組（n＝8）、順鉑加DHA 組（n＝8）、順鉑組（n＝8）。順鉑加DHA 組給予玉米油稀釋的DHA，500 mg·kg-1·d-1，灌胃體積2mL／kg，正常對照組、順鉑組給予等體積玉米油灌胃，均持續(xù)30d。順鉑用生理鹽水配制成0.25 mg／mL溶液，除正常對照組外均腹部注射順鉑溶液2.0mg·kg-1·d-1，于DHA 灌胃22d時(shí)開始，每日1次，每日定時(shí)灌胃，腹腔注射延后3min，持續(xù)8d。常規(guī)飲食，避免其他聽力損傷因素的干擾。順鉑注射前1d與第9天各組行腦干誘發(fā)電位（ABR）閾值雙耳檢測。隨后處死取右側(cè)耳蝸基底膜行染色鋪片，左側(cè)耳蝸行耳蝸縱軸石蠟切片HE染色。共48只耳蝸，各24只分別行耳蝸鋪片毛細(xì)胞殘余計(jì)數(shù)和耳蝸組織學(xué)切片，正常對照組8只，模型組8只，干預(yù)組8只。

1.2.2 ABR 檢測 開始用藥前1d和開始用藥后第9天分別測試ABR 閾值，1%戊巴比妥鈉40mg／kg體質(zhì)量腹部注射麻醉。受試動(dòng)物顱頂正中皮下為正極，給聲側(cè)耳廓后下為負(fù)極，接地電極于對側(cè)耳廓后下。發(fā)出2 000Hz為主的短聲刺激信號，間隔90ms，帶通濾波50～3 000 Hz，疊加200次，掃描時(shí)程20ms。聲刺激強(qiáng)度從95dB SPL 開始，以5dB逐次遞減，觀察P3波以判定兩側(cè)耳的ABR 閾值。

1.2.3 耳蝸組織切片及耳蝸鋪片 開始用藥后第9天處死動(dòng)物，取雙側(cè)聽泡。左側(cè)聽泡石蠟切片制備，于蝸尖鉆孔后灌注10%甲醛溶液0.5～1.0mL 并同種固定液中4 ℃過夜。10%EDTA 脫鈣1周后，常規(guī)石蠟包埋，平行蝸軸方向連續(xù)切片，切片厚度約6μm。行蘇木精-伊紅（HE）染色，封片，400倍光學(xué)顯微鏡下觀察螺旋神經(jīng)節(jié)形態(tài)學(xué)情況，攝片。目鏡加網(wǎng)格片，在400倍光學(xué)顯微鏡下直接計(jì)數(shù)蝸螺旋管中有核神經(jīng)節(jié)細(xì)胞數(shù)，從底回至頂回取7段，分別計(jì)數(shù)后相加取均值，即為每張切片每高倍視野均值計(jì)數(shù)，每只耳蝸連續(xù)計(jì)數(shù)5張中軸切片，再取其均值即為樣品每高倍計(jì)數(shù)均值。右側(cè)聽泡打開，蝸尖鉆孔，開放卵圓窗和圓窗。蝸尖0.5%硝酸銀溶液2～3次，確保從蝸窗處流出，25 mL／L 戊二醛同法灌入固定后自然光下曝光2～3h，取基底膜，分段平鋪，甘油封片。400倍光學(xué)顯微鏡下觀察毛細(xì)胞組織結(jié)構(gòu)及計(jì)數(shù)，毛細(xì)胞計(jì)數(shù)逐級從底回段到頂回段基底膜，毛細(xì)胞計(jì)數(shù)輸入計(jì)算機(jī)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)處理。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析處理，計(jì)量數(shù)據(jù)以±s表示，配對t檢驗(yàn)前后比較推斷造模是否成功，組間比較采用LSD-t檢驗(yàn)，以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 ABR 閾值測試結(jié)果 順鉑組ABR 閾值明顯較正常對照組升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），提示造模成功；順鉑加DHA 組ABR 閾值明顯低于順鉑組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；順鉑加DHA 組與順鉑組給藥后ABR 閾值明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見表1。

表1 3組實(shí)驗(yàn)動(dòng)物耳蝸實(shí)驗(yàn)前、后ABR 檢測 比較（n＝16，±s）

表1 3組實(shí)驗(yàn)動(dòng)物耳蝸實(shí)驗(yàn)前、后ABR 檢測 比較（n＝16，±s）

△：P＜0.05，與順鉑組比較；＊：P＜0.05，與同組給藥前1d 比較；▲：P＜0.05，與正常對照組比較。

ABR 閾 值（dB SPL）組別順鉑給藥前1d 順鉑給藥后第9天21.80±3.42 21.200±1.427順鉑加DHA 組 20.58±3.39 39.634±3.122＊△順鉑組 22.32±3.16 47.690±5.34正常對照組＊▲

2.2 耳蝸鋪片形態(tài)學(xué)觀察 耳蝸硝酸銀染色第二轉(zhuǎn)基底膜鋪片，顯示順鉑組外毛細(xì)胞數(shù)明顯較正常對照組下降，細(xì)胞排列紊亂，提示造模成功；順鉑加DHA 組毛細(xì)胞數(shù)高于順鉑組，細(xì)胞排列相對整齊，見圖1。

圖1 各組耳蝸鋪片及毛細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察（硝酸銀染色，×400）

圖2 螺旋神經(jīng)節(jié)組織切片（HE，×400）

2.3 耳蝸外毛細(xì)胞殘存率比較 外毛細(xì)胞殘存計(jì)數(shù)順鉑組較正常對照組低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。順鉑加DHA組外毛細(xì)胞殘存計(jì)數(shù)高于順鉑組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見表2。

表2 各實(shí)驗(yàn)組豚鼠耳蝸外毛細(xì)胞殘存計(jì)數(shù)比較（±s）

表2 各實(shí)驗(yàn)組豚鼠耳蝸外毛細(xì)胞殘存計(jì)數(shù)比較（±s）

＊：P＜0.01，與正常對照組比較；▲：P＜0.05，與順鉑組比較。

組別 耳數(shù)（n）毛細(xì)胞計(jì)數(shù)正常對照組8 1 042.650±33.690順鉑加DHA 組 8 725.029±116.640＊▲順鉑組 8 576.560±153.100＊

2.4 耳蝸組織切片觀察 耳蝸螺旋神經(jīng)節(jié)組織切片觀察 正常對照組未見明顯異常；順鉑組螺旋神經(jīng)節(jié)細(xì)胞數(shù)目減少，細(xì)胞退變明顯，胞核變小；順鉑加DHA 組螺旋神經(jīng)節(jié)細(xì)胞輕度退變，細(xì)胞核大小基本同正常對照組，見圖2。

2.5 螺旋神經(jīng)節(jié)細(xì)胞變化數(shù)量比較 順鉑組和順鉑加DHA組耳蝸中軸神經(jīng)節(jié)細(xì)胞變化數(shù)量比較，順鉑組與正常對照組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。順鉑加DHA 組螺旋神經(jīng)節(jié)有核細(xì)胞變化數(shù)量高于順鉑組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見表3。

表3 神經(jīng)節(jié)細(xì)胞變化數(shù)量比較（±s）

表3 神經(jīng)節(jié)細(xì)胞變化數(shù)量比較（±s）

＊：P＜0.05，與正常對照組比較；▲：P＜0.05，與順鉑組比較。

組別 耳數(shù)（n）神經(jīng)節(jié)細(xì)胞變化數(shù)正常對照組8 51.970±3.840順鉑加DHA 組 8 44.660±1.870＊▲順鉑組 8 41.083±2.960＊

3 討 論

順鉑化學(xué)名為順二氨二氯絡(luò)鉑，為鉑的金屬絡(luò)合物，為目前臨床常見、應(yīng)用廣泛的抗腫瘤藥物之一，但其耳腎毒性卻是臨床此類藥物使用中最棘手的問題，給患者生存質(zhì)量帶來了嚴(yán)重威脅，并嚴(yán)重限制了此類藥物的廣泛使用。動(dòng)物研究發(fā)現(xiàn)順鉑可通過耗竭耳蝸內(nèi)的谷胱甘肽和抗氧化酶［10］，經(jīng)過多氧自由基的損傷作用產(chǎn)生耳毒性［3，11］，順鉑還可以引發(fā)細(xì)胞凋亡［12］，降低耳蝸血流，導(dǎo)致內(nèi)耳缺血，并致螺旋神經(jīng)節(jié)損傷改變，進(jìn)而導(dǎo)致聽力喪失［13］。耳毒性成為順鉑最嚴(yán)重的不良反應(yīng)之一。目前，防治順鉑耳毒性的藥物主要為抗氧化維生素和神經(jīng)營養(yǎng)物質(zhì)，以及一些中醫(yī)傳統(tǒng)藥物，療效和安全性并不明確。基于順鉑耳毒性機(jī)理的多樣性，目前并無單一靶向的藥物來防治其耳毒性，因此，探尋新的防治順鉑耳毒性的新藥物將成為必然。DHA 是屬于不飽和脂肪酸一類而大量存在于體內(nèi)的物質(zhì)，成為內(nèi)生性的抗氧化劑之一，發(fā)現(xiàn)外源性DHA 攝入會(huì)顯著提高實(shí)驗(yàn)動(dòng)物腦內(nèi)超氧化物歧化酶（SOD）、過氧化氫酶（CAT）、谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-Px）水平，降低丙二醛（MDA）水平［14］。而且DHA 還可以通過降低血脂和抑制血小板降低血液黏稠度，進(jìn)而改善器官微循環(huán)。目前，通過細(xì)胞保護(hù)，增加器官血供，改善血液流變學(xué)參數(shù)，保護(hù)內(nèi)耳過氧化損傷成為神經(jīng)性聽力損傷的主要防治方法?；陧樸K耳毒性機(jī)理及DHA 的已有研究證據(jù)，本實(shí)驗(yàn)通過順鉑耳蝸損傷動(dòng)物模型，觀察DHA 攝入對順鉑所致耳蝸損傷的保護(hù)效果。結(jié)果顯示，順鉑加DHA 組的ABR 閾值明顯低于順鉑組，耳蝸Corti器基底膜的組織形態(tài)學(xué)改變也明顯輕于順鉑組，耳蝸外毛細(xì)胞殘存數(shù)也高于順鉑組，耳蝸螺旋神經(jīng)節(jié)細(xì)胞形態(tài)學(xué)改變優(yōu)于順鉑組，細(xì)胞殘存率數(shù)于順鉑組。提示外源性DHA 攝入對順鉑所致的豚鼠耳蝸損傷有一定的保護(hù)作用，可改善順鉑所致的耳蝸形態(tài)學(xué)改變，可能對臨床順鉑耳毒性的防治有一定的意義。本實(shí)驗(yàn)中DHA 對順鉑耳毒性的影響可能是通過其對實(shí)驗(yàn)動(dòng)物全身及耳蝸局部自由基代謝的影響，增強(qiáng)了機(jī)體的抗自由基的能力，從而降低了順鉑所致過多自由基對耳蝸毛細(xì)胞和螺旋神經(jīng)節(jié)的損傷，并通過降低血液黏稠度，改善血液流變學(xué)參數(shù)，增加耳蝸血流及降低炎性反應(yīng)等產(chǎn)生綜合保護(hù)性作用。DHA的作用可能類似一些天然抗氧化中藥，具有廣泛的間接或直接性作用，但DHA 對耳蝸的保護(hù)作用是否存在器官特異性的直接作用還需進(jìn)一步深入研究。從本實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果可推測DHA可能對臨床順鉑等抗腫瘤藥物的耳毒性防治有一定的意義，其作用機(jī)制和量效控制還需進(jìn)一步深入的探討。

［1］ McAlpine D，Johnstone BM.The ototoxic mechanism of cisplatin［J］.Hear Res，1990，47（3）：191-203.

［2］ Rybak LP，Whitworth CA，Mukherjea D，et al.Mechanisms of cisplatin-induced ototoxicity and prevention［J］.Hear Res，2007，226（1／2）：157-167.

［3］ Riedemann L，Lanvers C，Deuster D，et al.Megalin genetic polymorphisms and individual sensitivity to the ototoxic effect of cisplatin［J］.Pharmacogenomics J，2008，8（1）：23-28.

［4］ Tabuchi K，Nishimura B，Nakamagoe M，et al.Ototoxicity：mechanisms of cochlear impairment and its prevention［J］.Curr Med Chem，2011，18（31）：4866-4871.

［5］ Alam SA，Ikeda K，Oshima T，et al.Cisplatin-induced apoptotic cell death in Mongolian gerbil cochlear［J］.Hear Res，2000，141（1／2）：28-31.

［6］ Teranishi M，Nakashima T，Wakabayashi T.Effects of alphatocopherol on cisplatin-induced ototoxicity in guinea pigs［J］.Hear Res，2001，151（1／2）：61-65.

［7］ Wang J，Ladrech S，Pujol R，et al.Caspase inhibitors，butnotc-JunNH2-terminal kinase inhibitor treatment，prevent cisplatin-induced hearing loss［J］.Cancer Res，2004，64（24）：9217-9224.

［8］ Takayama F，Nakamoto K，Totani N，et al.Effects of docosahexaenoic acid in an experimental rat model of nonalcoholic steatohepatitis［J］.J Oleo Sci，2010，59（8）：407-414.

［9］ Park Y，Harris WS.Omega-3fatty acid supplementation accelerates chylomicron triglyceride clearance［J］.J Lipid Res，2003，44（3）：455-463.

［10］ Watanabe K，Hess A，Michel O，et al.Nitric oxide synthase inhibitor reduces the apoptotic change in the cisplatin treated cochler of guinea pigs［J］.Anticancer Drugs，2000，11（9）：731-738.

［11］ Ramírez-Camacho R，Citores MJ，Trinidad A，et al.HSP70as a nonspecific early marker in cisplatin ototoxicity［J］.Acta Otolaryngol，2007，127（6）：564-567.

［12］ Watanabe K，Jinnouchi K，Yagi T.Detection of single stranded DNA（SSDNA）in the vestibule of guinea pigs after the application of cisplatinum（CDDP）［J］.Anticancer Res，2001，21（2A）：35.

［13］ 黃世勇，陶澤璋，肖伯奎.連翹酯苷對順鉑耳毒性防護(hù)作用的實(shí)驗(yàn)研究［J］.聽力學(xué)及言語疾病雜志，2011，19（2）：152-156.

［14］ 蔣利和，馬博，謝正軼.二十二碳六烯酸對老年大鼠腦組織抗氧化和脂肪酸的影響［J］.食品科學(xué)，2011，32（13）：284-287.