鐘 源，孫善全

（重慶醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)教學(xué)管理中心人體大體形態(tài)學(xué)實(shí)驗(yàn)室 400016）

隨著溶栓治療、動脈搭橋術(shù)和氣囊成形術(shù)的廣泛應(yīng)用和發(fā)展，缺血再灌注損傷日益受到重視。研究表明，缺血再灌注導(dǎo)致的氧化應(yīng)激損傷在缺血性心臟病的發(fā)生、發(fā)展中起著重要的作用［1］。因此，在盡量縮短缺血再灌注時(shí)間的同時(shí)，尋找有效防治氧化應(yīng)激損傷的藥物，改善缺血再灌注心肌的代謝狀態(tài)，對減輕心肌缺血再灌注損傷有著重要的意義。番茄紅素（lycopene）是一種烴類胡蘿卜素，具有強(qiáng)有力的抗氧化作用，其清除單線態(tài)氧的能力是維生素E的100倍［2-3］。作者推測具有強(qiáng)抗氧化作用的番茄紅素在氧化應(yīng)激損傷中起著重要的心肌保護(hù)作用。本實(shí)驗(yàn)通過體外培養(yǎng)H9c2心肌細(xì)胞株建立氧化應(yīng)激模型，番茄紅素預(yù)處理后觀察氧化應(yīng)激損傷條件下細(xì)胞損傷、細(xì)胞凋亡、氧化應(yīng)激產(chǎn)物及線粒體功能的變化，探討其在氧化應(yīng)激損傷中的保護(hù)作用及機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料 H9c2心肌細(xì)胞株購自中國科學(xué)院上海細(xì)胞庫，DMEM／F12培養(yǎng)基和胎牛血清購自HyClone公司，番茄紅素購自美國Sigma公司，乳酸脫氫酶（LDH）、肌酸激酶同工酶（CKMB）和超氧化物歧化酶（SOD）測試試劑盒購自南京建成生物工程研究所，過氧化氫（H2O2）MTT 試劑盒，活性氧（ROS）探針DCFH-DA，BCA蛋白濃度試劑盒、線粒體膜電位探針（JC-1）和ATP 測試試劑盒購自江蘇碧云天生物技術(shù)有限公司。

1.2 方法

1.2.1 H9c2 心肌細(xì)胞株培養(yǎng)及氧化應(yīng)激模型建立 含有10%胎牛血清的DMEM／F12培養(yǎng)基，37℃5%CO2培養(yǎng)箱合適培養(yǎng)皿中培養(yǎng)H9c2心肌細(xì)胞，細(xì)胞密度達(dá)80%～90%后用于實(shí)驗(yàn)。H2O2用無血清DMEM／F12稀釋后制備成50、100、200、400μmol／L濃度梯度處理液，分別處理H9c2心肌細(xì)胞6 h，根據(jù)MTT 實(shí)驗(yàn)結(jié)果選擇最佳H2O2干預(yù)濃度。二甲基亞砜（DMSO）稀 釋 制 備 番 茄 紅 素 濃 度 梯 度1.25、2.50、5.00、10.00μmol／L，于H2O2干預(yù)前30min分別處理H9c2心肌細(xì)胞，根據(jù)MTT 實(shí)驗(yàn)結(jié)果選擇最佳番茄紅素干預(yù)濃度。

1.2.2 分組及處理 H9c2心肌細(xì)胞按105個(gè)／孔接種于6孔板，細(xì)胞密度達(dá)80%～90%后用于實(shí)驗(yàn)。分組及處理，正常對照組（對照組）：正常細(xì)胞培養(yǎng)液培養(yǎng)；番茄紅素處理組（Lycopene組）：正常細(xì)胞培養(yǎng)液中加入番茄紅素培養(yǎng)，余同對照組；模型組（H2O2組）：細(xì)胞于H2O2干預(yù)前，換無血清DMEM／F12培養(yǎng)基饑餓12h，然后加入最佳H2O2干預(yù)濃度培養(yǎng)6h；番茄紅素預(yù)處理后建立模型組（Lycopene加H2O2組）：細(xì)胞換無血清DMEM／F12 培養(yǎng)基饑餓12h，于H2O2干預(yù)前30 min加入最佳番茄紅素干預(yù)濃度處理，余同H2O2組。

1.2.3 MTT 測細(xì)胞存活率 根據(jù)MTT 試劑盒說明書操作如下：H9c2心肌細(xì)胞104個(gè)／孔接種于96 孔板，培養(yǎng)24h用于實(shí)驗(yàn)。不同濃度H2O2和番茄紅素分別干預(yù)細(xì)胞后每孔加入20μL（5mg／mL）MTT 試劑，37 ℃培養(yǎng)箱孵育4h，棄上清液，加入150μL DMSO，室溫?fù)u床10min，酶標(biāo)儀490nm 波長測光密度（OD 值）。

1.2.4 LDH、CK-MB、MDA 和SOD 水平檢測 H9c2心肌細(xì)胞按105個(gè)／孔接種于6孔板，相應(yīng)干預(yù)后取各組細(xì)胞培養(yǎng)液，分別按照LDH 和CK-MB試劑盒說明書進(jìn)行操作，應(yīng)用721D分光光度計(jì)測OD 值，檢測各組LDH 和CK-MB 水平。H9c2心肌細(xì)胞按105個(gè)／孔接種于6孔板，相應(yīng)干預(yù)后取各組細(xì)胞，裂解后1 600g離心10min，取上清液，按照SOD 和MDA 試劑盒說明書進(jìn)行操作，應(yīng)用721D 分光光度計(jì)測光密度值，BCA 蛋白濃度試劑盒測定各組培養(yǎng)液蛋白濃度，檢測各組細(xì)胞 內(nèi)SOD 和MDA 水 平。

1.2.5 激光共聚焦檢測細(xì)胞內(nèi)ROS水平及線粒體膜電位 H9c2心肌細(xì)胞按105個(gè)／孔接種于激光共聚焦皿，相應(yīng)干預(yù)后，分別加入ROS 探針DCFH-DA 10μmol／L 37 ℃孵育15 min；然后入線粒體膜電位JC-1探針10μg／mL 37 ℃孵育20 min；洗滌3 次，加入DMEM 500μL，激光共聚焦顯微鏡下觀察。

1.2.6 流式細(xì)胞技術(shù)檢測細(xì)胞內(nèi)ROS水平、細(xì)胞凋亡率和線粒體膜電位 H9c2心肌細(xì)胞按105個(gè)／孔接種于6孔板，相應(yīng)干預(yù)后，加入ROS 探針DCFH-DA 10μmol／L 37 ℃孵育60 min，磷酸鹽緩沖液（PBS）洗3次，胰酶消化收集細(xì)胞，500μL PBS重懸細(xì)胞后上流式細(xì)胞儀觀察，記錄各組細(xì)胞平均熒光強(qiáng)度。H9c2心肌細(xì)胞按105個(gè)／孔接種于6 孔板，相應(yīng)干預(yù)后PBS洗3次，胰酶消化收集細(xì)胞，加入Annexin-V 與PI核酸染料，輕搖混勻，避光室溫放置15min，加入結(jié)合緩沖液400μL，1h內(nèi)上流式細(xì)胞儀測定。應(yīng)用Cell Quest軟件獲取和分析數(shù)據(jù)，Annexin-VFITC（X 軸）與PI（Y 軸）熒光做對數(shù)散點(diǎn)圖，可獲得由左下、左上、右上、右下4個(gè)象限，其中，左下象限為活細(xì)胞，右下象限為早期凋亡細(xì)胞，左上象限為細(xì)胞收集過程中產(chǎn)生的損傷細(xì)胞，右上象限為晚期凋亡細(xì)胞和壞死細(xì)胞。細(xì)胞凋亡率為右下象限加右上象限百分比之和。H9c2 心肌細(xì)胞按105個(gè)／孔接種于6孔板，相應(yīng)干預(yù)后PBS洗3次，胰酶消化收集細(xì)胞，加入JC-1探針10μg／mL 37 ℃孵育20 min，500μL PBS重懸細(xì)胞后上流式細(xì)胞儀觀察。通過熒光通道FL1（綠）和FL2（紅）檢測熒光強(qiáng)度，應(yīng)用Cell Quest軟件獲取和分析數(shù)據(jù)，線粒體膜電位的高低用FL2（紅）與FL1（綠）的比值表示。1.2.7 細(xì)胞內(nèi)ATP 水平檢測 H9c2心肌細(xì)胞按105個(gè)／孔接種于6孔板，相應(yīng)干預(yù)后取各組細(xì)胞，裂解后1 600g離心10min，取上清液，按照ATP 測試試劑盒說明書進(jìn)行操作，酶標(biāo)儀檢測光密度值（RLU 值），BCA 蛋白濃度試劑盒測定各組培養(yǎng)液蛋白濃度，檢測各組細(xì)胞內(nèi)ATP水平。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SAS9.1統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，計(jì)量資料以±s表示。多組間均數(shù)比較采用單因素方差分析，均數(shù)兩兩比較采用SNK 檢驗(yàn)，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 不同濃度H2O2對H9c2心肌細(xì)胞存活率的影響 結(jié)果顯示，與對照組比較，不同濃度H2O2（50、100、200、400μmol／L）處理H9c2心肌細(xì)胞6h均可降低H9c2心肌細(xì)胞存活率，且隨著H2O2濃度的升高，細(xì)胞存活率降低（P＜0.05）。而H2O2濃度為200 μmol／L 處理時(shí)，心肌細(xì)胞存活率為48.38%，接近50.00%，提示200μmol／L濃度的H2O2能夠兼顧體現(xiàn)氧化應(yīng)激損傷和適當(dāng)?shù)募?xì)胞活力，故在后續(xù)實(shí)驗(yàn)中選擇200μmol／L H2O2作為建立氧化應(yīng)激模型的干預(yù)濃度，見圖1。

圖1 MTT 觀察H2O2 對各組H9c2心肌細(xì)胞存活率的影響

2.2 番茄紅素對H9c2 心肌細(xì)胞的細(xì)胞毒性 實(shí)驗(yàn)中將H9c2心肌細(xì)胞分別用1.25、2.50、5.00、10.00、20.00、40.00 μmol／L的番茄紅素處理，培養(yǎng)24h后檢測細(xì)胞存活率（圖2）。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，1.25、2.50、5.00μmol／L 番茄紅素對H9c2心肌細(xì)胞存活率無明顯影響，其存活率分別為（98.52±0.64）%、（97.89±0.40）%、（97.65±0.90）%。當(dāng)番茄紅素濃度為10.00、20.00、40.00μmol／L時(shí)，與對照組比較，細(xì)胞存活率明顯減少，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），存活率分別為（96.65±1.02）%、（90.09±3.72）%、（76.60±2.03）%。

圖2 MTT 觀察Lycopene對H9c2心肌細(xì)胞存活率的影響

2.3 不同濃度番茄紅素對氧化應(yīng)激損傷H9c2心肌細(xì)胞存活率的影響 為了評價(jià)番茄紅素對氧化應(yīng)激條件下H9c2心肌細(xì)胞保護(hù)作用，不同濃度的番茄紅素（1.25、2.50、5.00、10.00 μmol／L）于建模前30min加入。結(jié)果顯示，與H2O2組比較，不同濃度的番茄紅素可以顯著改善細(xì)胞存活率（P＜0.05），并在5μmol／L達(dá)到最高，故在后續(xù)實(shí)驗(yàn)中選擇5μmol／L番茄紅素作為干預(yù)濃度，見圖3。

圖3 MTT 觀察Lycopene對各組H9c2心肌細(xì)胞存活率的影響

2.4 番茄紅素對氧化應(yīng)激損傷條件下LDH、CK-MB 及細(xì)胞凋亡的影響 結(jié)果顯示，與對照組比較，H2O2組培養(yǎng)液中的LDH 和CK-MB水平明顯升高，細(xì)胞凋亡率明顯升高，且差異有統(tǒng)計(jì) 學(xué) 意 義（P＜0.05）。與H2O2組比較，Lycopene 加H2O2組LDH 和CK-MB 水平明顯降低，細(xì)胞凋亡率明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見表1。

表1 Lycopene對各組LDH、CK-MB水平 及細(xì)胞凋亡的影響（±s，n＝3）

表1 Lycopene對各組LDH、CK-MB水平 及細(xì)胞凋亡的影響（±s，n＝3）

a：P＜0.05，與對照組比較；b：P＜0.05，與H2O2 組比較。

組別 LDH（U／L） CK-MB（U／L） 細(xì)胞凋亡率（%）102.75±3.26 1.44±0.08 7.06±0.24 Lycopene組 99.32±2.18 1.41±0.04 7.08±0.18 H2O2 組 197.44±3.6a 10.45±0.77a 27.35±0.88a Lycopene加H2O2 組 137.62±3.84ab 5.54±0.33ab 16.10±1.14對照組ab

2.5 番茄紅素對氧化應(yīng)激損傷條件下細(xì)胞內(nèi)ROS、SOD 和MDA 的影響 結(jié)果顯示，與對照組比較，H2O2組H9c2心肌細(xì)胞中ROS和MDA 水平明顯升高，而SOD 水平明顯下降，且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。與H2O2組比較，Lycopene預(yù)處理能夠明顯降低H9c2心肌細(xì)胞中ROS和MDA 水平，能夠升高細(xì)胞中SOD 水平，且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見表2。激光共聚焦檢測發(fā)現(xiàn)，與對照組比較，H2O2組ROS熒光增強(qiáng)，提示H2O2條件下ROS生成增加；與H2O2組比較，Lycopene加H2O2組ROS 熒光減弱，提示Lycopene可減少H／R 條件下ROS生成，見圖4。

表2 Lycopene對各組細(xì)胞ROS、SOD 和 MDA 的影響（±s，n＝3）

表2 Lycopene對各組細(xì)胞ROS、SOD 和 MDA 的影響（±s，n＝3）

a：P＜0.05，與對照組比較；b：P＜0.05，與H2O2 組比較。

組別 ROS（%） MDA（nmol／mg protein）SOD（U／mg protein）99.67±0.63 11.26±0.31 13.77±1.09 Lycopene組 98.47±6.02 10.18±0.41 15.38±2.37 H2O2 組 148.72±5.32a 28.59±1.19a 6.11±0.27a Lycopene加H2O2 組對照組120.60±1.19ab 16.59±0.92ab 9.30±0.42 ab

圖4 激光共聚焦檢測H9c2心肌細(xì)胞ROS水平

表3 Lycopene對各組細(xì)胞ATP及線粒體膜 電位的影響（±s，n＝3）

表3 Lycopene對各組細(xì)胞ATP及線粒體膜 電位的影響（±s，n＝3）

a：P＜0.05，與對照組比較；b：P＜0.05，與H2O2 組比較。

組別 ATP（nmol／mg protein）線粒體膜電位對照組12.63±1.35 1.97±0.03 Lycopene組 12.74±1.47 1.89±0.05 H2O2 組 3.93±0.35a 0.60±0.09a Lycopene加H2O2 組 8.10±0.64ab 1.10±0.06 ab

2.6 番茄紅素對氧化應(yīng)激損傷條件下細(xì)胞ATP 水平及線粒體膜電位的影響 結(jié)果顯示，與對照組比較，H2O2組H9c2心肌細(xì)胞中ATP水平及線粒體膜電位明顯降低，且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。與H2O2組比較，Lycopene預(yù)處理能夠明顯升高H9c2心肌細(xì)胞中ATP 水平及線粒體膜電位，且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見表3。激光共聚焦檢測發(fā)現(xiàn)，與對照組比較，H2O2組JC-1探針綠色熒光強(qiáng)度增強(qiáng)，紅色熒光強(qiáng)度減弱，提示H2O2條件下ΔΨm 降低；與H2O2組比較，Lycopene加H2O2組JC-1探針綠色熒光強(qiáng)度減弱，紅色熒光強(qiáng)度增強(qiáng)，提示Lycopene可升高H／R 條件下ΔΨm，見圖5。

3 討 論

氧化應(yīng)激是心肌缺血再灌注損傷的主要病理生理機(jī)制［1，4］。研究表明，給予抗氧化藥物或者提高內(nèi)源性抗氧化酶的活性，能夠有效減輕心肌的缺血再灌注損傷［5-6］。番茄紅素是一種植物精華素，具有很強(qiáng)的抗氧化作用［2-3］。本實(shí)驗(yàn)旨在探討番茄紅素對氧化應(yīng)激損傷條件下對心肌細(xì)胞的保護(hù)作用及機(jī)制。

本研究發(fā)現(xiàn)，不同濃度的H2O2處理H9c2 心肌細(xì)胞6h均可降低H9c2心肌細(xì)胞存活率，且隨著H2O2濃度的升高，細(xì)胞存活率降低。表明采用H2O2建立氧化應(yīng)激模型成功。這一結(jié)果與庾輝等［7］報(bào)道的結(jié)果相似。為了研究番茄紅素對細(xì)胞的保護(hù)作用，本研究采用了不同濃度梯度預(yù)處理氧化應(yīng)激條件下的H9c2心肌細(xì)胞，結(jié)果顯示，不同濃度的番茄紅素能夠明顯提高細(xì)胞的存活率，表明番茄紅素對氧化應(yīng)激條件下H9c2心肌細(xì)胞具有較好的保護(hù)作用。LDH 和CK-MB 是心肌細(xì)胞損傷的生物標(biāo)志物。為了進(jìn)一步探討番茄紅素對心肌細(xì)胞損傷的保護(hù)作用，本研究進(jìn)一步檢測了細(xì)胞培養(yǎng)液中LDH 和CK-MB的水平。結(jié)果顯示，番茄紅素能夠明顯降低氧化應(yīng)激條件下LDH 和CK-MB 的水平，進(jìn)一步表明番茄紅素能夠減輕氧化應(yīng)激條件下心肌細(xì)胞的損傷。

心肌缺血再灌注誘導(dǎo)產(chǎn)生的氧化應(yīng)激在心肌細(xì)胞凋亡的過程中起著重要的作用［4，8］。本研究發(fā)現(xiàn)，H2O2處理H9c2心肌細(xì)胞6h后心肌細(xì)胞的凋亡率明顯增加，而番茄紅素預(yù)處理可以明顯減低H2O2所引起的H9c2心肌細(xì)胞凋亡。線粒體是細(xì)胞能量的供應(yīng)站，也是氧化應(yīng)激產(chǎn)物ROS的主要來源，在維持細(xì)胞內(nèi)離子水平的穩(wěn)定、壞死信號放大、介導(dǎo)細(xì)胞凋亡等方面也起著重要作用［9-10］。ROS和MDA 是氧化應(yīng)激的主要產(chǎn)物，其水平的高低反映了細(xì)胞受自由基攻擊和損傷的程度［11］。SOD 是細(xì)胞內(nèi)一種抗氧化酶，其水平的高低可以間接反映細(xì)胞內(nèi)抗氧化能力［12］。本研究發(fā)現(xiàn)，番茄紅素可以明顯降低氧化應(yīng)激條件下H9c2心肌細(xì)胞內(nèi)ROS和MDA 水平，升高細(xì)胞內(nèi)SOD 水平，表明番茄紅素可以有效降低H2O2所誘導(dǎo)產(chǎn)生的氧化應(yīng)激，其減輕氧化應(yīng)激條件下心肌細(xì)胞的損傷可能與清除細(xì)胞內(nèi)氧化應(yīng)激產(chǎn)物（如ROS、MDA）和增加細(xì)胞內(nèi)抗氧化酶（如SOD）有關(guān)。

細(xì)胞內(nèi)ATP水平和線粒體膜電位高低是反映線粒體功能狀態(tài)的重要指標(biāo)。既往研究表明，心肌缺血再灌注所誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激損傷可以導(dǎo)致線粒體功能障礙表現(xiàn)為ATP產(chǎn)生和線粒體膜電位降低［13-14］。本研究也發(fā)現(xiàn)H2O2所誘導(dǎo)產(chǎn)生的氧化應(yīng)激可以明顯降低細(xì)胞內(nèi)ATP 水平和線粒體膜電位；而番茄紅素預(yù)處理可以顯著增加細(xì)胞內(nèi)ATP 的產(chǎn)生，升高線粒體膜電位，表明番茄紅素可以有效改善氧化應(yīng)激條件下心肌線粒體的功能。

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