鐘 武，楊 帆，陳睦虎，吳 剛

（四川醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院：1.急診科；2.感染科，四川瀘州646000）

靜脈性潰瘍是慢性靜脈功能不全發(fā)展到晚期并發(fā)癥之一［1］，主要表現(xiàn)為下肢踝周皮膚缺損、慢性感染，臨床愈合困難。有研究表明，潰瘍形成與病變組織中存在的氧化應(yīng)激，炎癥介質(zhì)釋放，激活血管內(nèi)皮細胞（vascular endothelial cells，VECs）凋亡，抑制血管再生等因素關(guān)系密切［2］，所以本研究針對靜脈性潰瘍組織與其他潰瘍組織的血管內(nèi)皮修復(fù)能力進行了對比實驗研究，意在揭示血管再生障礙與靜脈性潰瘍發(fā)病機制的相關(guān)性，現(xiàn)報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2013年10月至2014年12月本院收治的72 例下肢潰瘍患者潰瘍創(chuàng)面及正常皮膚標本，其中男50例，女22例，年齡51～72歲，平均（61.5±2.53）歲。試驗對象首先排除動脈基礎(chǔ)性疾病。按以下標準分組：（1）靜脈性潰瘍組24例，取下肢靜脈功能不全合并潰瘍患者潰瘍組織，大小約0.5cm×0.5cm；按病程分為A 組（急性組）8例，病程小于3周；B組（亞急性組）：8例，病程3周至2個月；C組（慢性組）：8例，病程大于2個月；（2）創(chuàng)傷潰瘍組：24例，取下肢皮膚挫裂傷患者潰瘍創(chuàng)面標本，病程分組法同第一組；（3）正常皮膚對照組：24例，取下肢淺表良性腫瘤梭形切除術(shù)中與病灶一同切下的正常皮膚。

1.2 方法

1.2.1 組織石蠟切片的制備 按操作常規(guī)制作石蠟切片，對潰瘍標本、正常皮膚標本作HE 染色，并作血管內(nèi)皮細胞生長因子受體2（VEGFR2）、CD34、CD133免疫組織化學(xué)染色。

1.2.2 RT-PCR 檢測VEGFR2mRNA 水平 檢索GenBank公布的基因序列，設(shè)計VEGFR 基因引物：正向引物：5′-CCT CAT TCA TAT TGG TCA CCA TCT C-3′；反向引物：5′-CTC CTC AGG GTG GAC AGG TTT-3′。所擴增的目的片段長度約為126bp。β-actin基因引物：正向引物：5′-GTG GAC ATC CGC AAA GA-3′；反 向 引 物：5′-CTC GTC ATA CTC CTG CTT G-3′。所擴增的目的片段長度約為234bp。計算目標基因片斷電泳條帶密度相對系數(shù)。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS19.0統(tǒng)計軟件進行分析，計量資料以±s表示，采用t檢驗，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 HE 染色結(jié)果 潰瘍組織及正常皮膚HE 染色結(jié)果，見圖1。

2.2 免疫組織化學(xué)染色 選取病程大于2個月病變典型組織及正常皮膚對比，棕黃色細胞為陽性表達，見圖2。

圖1 潰瘍組織及正常皮膚HE染色（×100）

圖2 潰瘍組織及正常皮膚免疫組織化學(xué)染色（×200，↑為VEGFR2陽性表達）

2.3 RT-PCR檢測VEGFR2mRNA 表達相對系數(shù) 正常皮膚對照組為0.772±0.023；創(chuàng)傷潰瘍A 組為0.774±0.014，靜脈性潰瘍A 組為0.683±0.021，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。在B組和C組潰瘍組織中，與創(chuàng)傷潰瘍組（0.856±0.049，0.985±0.032）及正常皮膚對照組（0.772±0.023）比較，靜脈性潰瘍（0.407±0.014，0.249±0.088）表達明顯降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。不同病程靜脈性潰瘍組內(nèi)比較，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），見表1，圖3。

圖3 各組潰瘍組織VEGFR2mRNA 表達

表1 各組潰瘍組織VEGFR2mRNA 相對系數(shù)（±s）

表1 各組潰瘍組織VEGFR2mRNA 相對系數(shù)（±s）

◆：P＜0.05，與同時間段正常皮膚對照組比較；◇：P＜0.05，與同時間段靜脈性潰瘍組比較；＊：P＜0.05，組內(nèi)比較；-：表示此項無數(shù)據(jù)。

組別 n病程小于3周 大于3周至2個月 大于2個月正常皮膚正常組24 0.772±0.023 - -創(chuàng)傷潰瘍組 24 0.774±0.014 0.856±0.049 0.985±0.032靜脈性潰瘍組 24 0.683±0.021＊ 0.407±0.014◆◇＊ 0.249±0.088◆◇＊

3 討 論

VECs由內(nèi)皮祖細胞（endothelial progenitor cells，EPCs）分化而來，在體內(nèi)EPCs是缺血組織血管新生、受損內(nèi)皮細胞修復(fù)和合成的重要前體［3］。組織損傷修復(fù)依賴于受損局部的血供情況［4］，而血管新生除了需要多種促生長因子的協(xié)同作用（如VEGF、FGF、EGF等），更重要的是有足夠數(shù)量的EPCs參與［5］，所以說EPCs根據(jù)組織需要，從骨髓動員，并遷移至損傷部位，動態(tài)調(diào)節(jié)內(nèi)皮細胞凋亡／再生平衡，其在損傷局部的表達情況是評估組織損傷后修復(fù)能力重要標準［6-7］。

VEGF共有3 種酪氨酸激酶受體：VEGFR1、VEGFR2、VEGFR3，VEGF與其受體VEGFR2 結(jié)合后主要生理學(xué)效應(yīng)是正性調(diào)節(jié)有絲分裂和血管形成，促進新生血管內(nèi)膜及管腔樣結(jié)構(gòu)的形成［8］，為組織損傷修復(fù)提供充足的血供及穩(wěn)定的內(nèi)環(huán)境［9-10］。當前認為，CD34、CD133和VEGFR2是表達于EPCs表面特異性較高的標記組合［11］，筆者采用CD34、CD133、VEGFR2陽性表達細胞來鑒定EPCs，目的是根據(jù)損傷組織EPCs表達情況間接評估潰瘍組織潛在修復(fù)能力。

本研究HE染色發(fā)現(xiàn)靜脈性潰瘍上皮細胞結(jié)構(gòu)紊亂，基底部大量炎癥細胞浸潤，缺乏毛細血管分布；創(chuàng)傷潰瘍基底部肉芽組織增生，新生毛細血管豐富，進一步比較兩種潰瘍組織血管新生功能的差異。本研究對VEGFR2、CD34、CD133進行免疫組織化學(xué)染色，靜脈性潰瘍組明顯低于正常皮膚對照組，并且RT-PCR半定量檢測VEGFR2mRNA 水平顯示，病程大于3周至2個月和大于2個月靜脈性潰瘍組低于創(chuàng)傷潰瘍組，隨著病程延長其水平明顯下降，表明創(chuàng)傷性潰瘍組中VEGFR2隨病程延長呈現(xiàn)代償性增生，其轉(zhuǎn)歸演變符合普通潰瘍愈合的病理、生理學(xué)規(guī)律，而靜脈性潰瘍組織在已供血障礙的基礎(chǔ)之上，EPCs的數(shù)量和功能受到明顯抑制，在損傷局部不能分化為成熟的VECs，進而形成功能性新生血管，完成內(nèi)皮損傷后自我修復(fù)過程［12］，血管內(nèi)皮層的完整性受到嚴重破壞，潰瘍組織難以得到充足的血供，這種惡性循環(huán)效應(yīng)可能是潰瘍創(chuàng)面經(jīng)久不愈的重要原因［13］。

綜上所述，靜脈性潰瘍組織VEGFR2的表達情況有別于其他病理性潰瘍，有自身的規(guī)律和特點，但導(dǎo)致潰瘍組織EPCs功能抑制進而引起局部血管新生障礙，組織代謝紊亂，缺氧壞死的分子生物學(xué)機制還有待于深入研究。

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