賀龍珠，張 波，劉 蘋，張世昌，翁土軍，梁 鑫，李芳菲，屈 晨，王 萍▲

（1.重慶醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院口腔科 400016；2.第三軍醫(yī)大學大坪醫(yī)院野戰(zhàn)外科研究所第四研究室，重慶400042）

創(chuàng)傷修復愈合是多種細胞、生長因子與周圍介質(zhì)相互作用的結(jié)果。血管化困難是難愈性創(chuàng)面發(fā)生的重要原因，特別是糖尿病患者，損傷后傷口難以愈合，經(jīng)常發(fā)展成為慢性潰瘍。目前研究顯示使用血管內(nèi)皮細胞生長因子、植皮等常規(guī)治療方法對難愈創(chuàng)面難以達到理想的治療效果。內(nèi)皮祖細胞（endothelial progenitor cells，EPCs）作為血管化發(fā)生前體細胞，可通過移植入難愈創(chuàng)面，促進血管新生及創(chuàng)面愈合［1-3］。目前體外研究EPCs的組織來源主要有骨髓、臍血、脂肪組織等。目前實驗多側(cè)重于研究不同來源的EPCs體外分離培養(yǎng)方法，系統(tǒng)的生物學特性的比較研究較少。本實驗分別從大鼠骨髓及脾臟組織中分離培養(yǎng)及鑒定EPCs，并比較EPCs的增殖、遷移、黏附和一氧化氮（nitric oxide，NO）分泌等生物學特性，為EPCs體外實驗研究的組織來源選擇提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物 4周齡雄性Sprague-Dawley（SD）大鼠（第三軍醫(yī)大學大坪醫(yī)院野戰(zhàn)外科研究所實驗動物中心提供），清潔級，體質(zhì)量（70±15）g。

1.1.2 主要試劑 胎牛血清（FBS）購自美國Gibco公司；大鼠淋巴細胞分離液、纖連蛋白、綠色熒光標記的荊豆凝集素（FITC-UEA-1）購自美國Sigma公司；低糖DMEM 培養(yǎng)液購自美國HyClone公司；血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）、堿性成纖維細胞生長因子（bFGF）購自美國Peprotech公司；DiI熒光標記的乙?；兔芏戎鞍祝―iI-ac-LDL）購自美國Molecular Probes公司；結(jié)晶紫染液購自中國碧云天公司；NO 檢測試劑盒購自中國南京建成生物工程研究所。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養(yǎng) 選用約70g的雄性清潔級SD 大鼠，斷頸處死，消毒，迅速提取其脾臟、股骨和脛骨，收集細胞懸液。將脾臟和骨髓細胞懸液分別加于淋巴細胞分離液之上。1 500r／min離心20min后，液體分為4 層，用吸管將中間云霧狀白膜層的單個核細胞吸取到另一離心管中，無菌磷酸鹽緩沖液（PBS）洗滌2次（1 500r／min，離心8 min），棄上清液，用全培養(yǎng)基，含20%FBS、VEGF 10ng／mL、bFGF 10ng／mL、青霉素100IU／mL及鏈霉素100IU／mL 的低糖DMEM 重懸，以1×107／mL接種于纖連蛋白預先包被好的6孔板，置于37℃，5%CO2，飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。倒置顯微鏡下觀察細胞形態(tài)。

1.2.2 攝取DiI-ac-LDL 與結(jié)合FITC-UEA-1 實驗 接種于24孔板內(nèi)培養(yǎng)7d的貼壁細胞，更換新鮮全培養(yǎng)基1mL，以每孔體積分數(shù)1%的比例加入DiI-ac-LDL 10mg／L，置于CO2培養(yǎng)箱中孵育1h取出后用PBS漂洗3 次，每次5min；再以4%多聚甲醛固定10 min后，用PBS漂洗3次，每次5 min；加入10μL FITC-UEA-1 10mg／L繼續(xù)置于培養(yǎng)箱中孵育1h，PBS漂洗，4′，6-二脒基-2-苯基吲哚（4′，6-diamidino-2-phenylindole，DAPI）染色細胞核，熒光顯微鏡觀察并拍照。能夠同時吞噬DiI-ac-LDL 和FITC-UEA-1 的細胞可以鑒定為正在分化的EPCs。

1.2.3 增殖能力檢測 采用噻唑藍（MTT）法檢測EPCs的增殖能力。取0.25%的胰酶-乙二胺四乙酸（EDTA）溶液消化收集培養(yǎng)7d左右的原代EPCs，使用全培養(yǎng)基重懸，調(diào)整細胞密度為5×105／mL。將細胞懸液接種到包被纖連蛋白的96孔培養(yǎng)板中，每孔200μL，設調(diào)零孔（不加細胞，僅加入200μL新鮮全培養(yǎng)基），每組重復6孔。每培養(yǎng)24h后，以每孔體積分數(shù)10%的比例加入MTT（5 mg／mL），置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中再培養(yǎng)4h；輕柔棄去上清液，每孔加150μL 的二甲基亞砜（DMSO）溶液，常溫下在振蕩儀上振蕩10min，于酶標儀上490nm 波長處測定各孔吸光度（A）值。

1.2.4 黏附功能檢測 0.25%的胰酶-EDTA 溶液消化收集培養(yǎng)7d左右的原代貼壁細胞，按照2×104／孔的密度接種在已包被纖連蛋白的48 孔板中，放入CO2培養(yǎng)箱30 min 后，PBS輕柔洗去未黏附的細胞，已貼壁細胞用4%多聚甲醛固定，DAPI染色細胞核，顯微鏡下（×200）進行細胞計數(shù)。

1.2.5 遷移能力檢測 0.25%的胰酶-EDTA 溶液消化收集培養(yǎng)7d左右的原代貼壁細胞，用含體積分數(shù)0.1%FBS低糖DMEM 培養(yǎng)基調(diào)整細胞密度為2×106／mL，取0.4mL細胞懸液于8μm 孔徑的插入式培養(yǎng)小室內(nèi)，放入含體積分數(shù)20%FBS低糖DMEM 培養(yǎng)基中，37 ℃、5%CO2恒溫箱培養(yǎng)24h。取出插入式培養(yǎng)小室，用棉簽擦去小室底部濾膜上層細胞，4%多聚甲醛內(nèi)固定10min，經(jīng)雙蒸水反復浸洗并干燥后，用0.1%結(jié)晶紫對濾膜下層細胞染色。

1.2.6 分泌NO 功能檢測 收集7d左右的原代貼壁細胞上清為樣品，按照NO 檢測試劑盒說明操作。根據(jù)標準品計算出樣品中NO 的水平。

1.3 統(tǒng)計學處理 采用SPSS 13.0軟件進行統(tǒng)計分析。計量資料以±s表示，組間統(tǒng)計采用t檢驗，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié) 果

2.1 倒置顯微鏡下不同來源EPCs形態(tài)學觀察 新分離的骨髓來源單個核細胞為小圓形。培養(yǎng)3d后，可見部分細胞貼壁，約占整個視野的40%左右，貼壁細胞大多呈圓形，形成集落樣，集落較小且松散，未形成集落的貼壁細胞大多呈梭形及不規(guī)則形（圖1A）。7d后長梭形及不規(guī)則細胞數(shù)量顯著增多，形成大量集落，集落的中央主要為圓形細胞群，周圍的細胞呈放射狀，類似于血島，集落體積較大且穩(wěn)固貼于瓶壁上，折光率高（圖1B），細胞融合率85%以上（圖1C）。脾臟來源的單個核細胞初始形態(tài)類似于骨髓來源（圖1D）。培養(yǎng)3d后，貼壁細胞數(shù)量較骨髓來源少，大部分呈圓形，形成集落，松散漂浮于瓶壁上，僅可見極少量梭型細胞（圖1E），培養(yǎng)7d少量細胞集落形成（圖1F），細胞較松散。

圖1 倒置顯微鏡下不同來源EPCs形態(tài)學觀察（×200）

圖2 EPCs鑒定（×200）

圖3 脾臟和骨髓來源EPCs生物學特性比較

2.2 EPCs鑒定 EPCs吞噬DiI-ac-LDL后細胞質(zhì)呈紅色，攝取FITC-UEA-1后細胞質(zhì)呈綠色，紅色和綠色熒光重合后呈現(xiàn)黃色熒光，為正在分化的EPCs。激光共聚焦觀察，脾臟和骨髓單個核細胞培養(yǎng)7d時，二者均可形成雙染黃色熒光細胞，見圖2。

2.3 不同來源EPCs功能比較 增殖實驗生長曲線結(jié)果顯示，骨髓和脾臟來源EPCs培養(yǎng)前3d無明顯增殖，細胞處于潛伏期；3d后細胞進入對數(shù)期，呈指數(shù)遞增；6d后細胞進入平臺期。3d后，從增殖曲線的趨勢來看，骨髓源EPCs相對于脾臟源EPCs，增殖能力更強（圖3A）。黏附實驗結(jié)果顯示，計數(shù)兩組貼壁細胞數(shù)量發(fā)現(xiàn)骨髓源EPCs貼壁細胞數(shù)量顯著高于脾臟源EPCs（圖3B）。遷移實驗結(jié)果顯示，骨髓源組遷移至小室外側(cè)的細胞數(shù)量明顯多于脾臟源EPCs。統(tǒng)計兩組遷移至小室外側(cè)的細胞發(fā)現(xiàn)脾臟源EPCs遷移至小室外側(cè)的細胞數(shù)量顯著低于骨髓源EPCs（圖3C）。檢測兩組細胞培養(yǎng)上清中NO的分泌量發(fā)現(xiàn)兩組來源EPCs的NO 分泌能力有顯著性差異，表明脾臟源EPCs的NO 分泌能力較弱（圖3D）。

3 討 論

在創(chuàng)面愈合這一復雜的生理過程中，炎性反應、肉芽組織形成、細胞增殖和組織重建等階段在不同時段發(fā)揮著不同作用。血管化困難是難愈性創(chuàng)面發(fā)生的重要原因。創(chuàng)面形成新生血管的速度、密度和質(zhì)量直接關系創(chuàng)傷的預后。研究表明傷后24h，創(chuàng)面附近大量內(nèi)皮細胞（EC）增殖形成新生血管［3］。內(nèi)皮細胞是一種終末細胞，其增殖能力較弱，EPCs是具有潛在分化成為成熟內(nèi)皮細胞的細胞［4］，相對于成熟內(nèi)皮細胞增殖能力強［5］。因此，EPCs對促進創(chuàng)面愈合及缺血部位血管新生起著關鍵性作用［6］。目前，大部分研究者認為EPCs主要發(fā)源于骨髓，只在某些生理、病理狀態(tài)下釋放，通過循環(huán)運行至受損部位［7-8］。國內(nèi)外有關EPCs研究較多集中在骨髓、臍血和外周血方面。外周血中EPCs的水平極低［9］，體外擴增能力也相對較弱，其應用受到限制。臍帶血單個核細胞體外培養(yǎng)時能產(chǎn)生更多EPCs［10］，但由于臍帶血難以獲取及相關倫理問題，移植治療受到很大限制。骨髓中含有豐富的EPCs，取材方便，而且取自身骨髓不存在免疫問題，所以骨髓源EPCs極具研究價值和應用前景。但對于小動物來說，活體提取骨髓操作較難。脾臟作為EPCs體外提取的組織來源，優(yōu)點在于可以在保持動物存活的基礎上，提取自體EPCs用于后期自體移植實驗，不涉及免疫的問題。目前對脾臟源EPCs生物學特性研究較少，無法判斷脾臟EPCs細胞體外生物學功能是否能用于體外移植。本實驗首先通過分離骨髓和脾臟兩種不同來源的EPCs，誘導培養(yǎng)7d后，形態(tài)學觀察發(fā)現(xiàn)細胞大量形成類似于血島樣集落，同時根據(jù)其能夠特異性吞噬DiI-ac-LDL 并結(jié)合FITCUEA-1［11］鑒定其均為EPCs，證實脾臟和骨髓均能提取到較純的EPCs［12］。

本實驗對兩種來源的EPCs的增殖、黏附、遷移和NO 分泌等體外生物學特性進行了比較。血管新生過程中，EPCs能夠識別損傷和缺血部位的分子信號，動員至受損部位，黏附于缺血組織，遷移趨化至相應創(chuàng)傷部位，然后大量增殖分化為內(nèi)皮細胞，促進創(chuàng)面新生血管生成。在這一過程中，EPCs黏附、增殖、遷移和NO 分泌能力起著重要的作用。體外MTT 實驗、插入式培養(yǎng)小室等實驗結(jié)果顯示骨髓源EPCs相對于脾臟源，其增殖、黏附、遷移能力和NO 分泌能力更強，這意味著在血管新生過程中，骨髓源EPCs促進創(chuàng)面的愈合能力可能更強。綜述所述，從骨髓中培養(yǎng)出的EPCs不僅增殖力優(yōu)于脾臟源EPCs，而且在促進血管生成的部分生物學功能上也強于脾臟源EPCs，提示骨髓可能更適宜作為體外培養(yǎng)EPCs的組織來源。

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