陳源紅，趙麗娟，梁有龍，張卓華，曾 怡△

（右江民族醫(yī)學(xué)院：1.微生物學(xué)與免疫學(xué)教研室；2.臨床本科2011級8班，廣西百色533000）

卡波氏肉瘤相關(guān)皰疹病毒（Kaposi′s sarcoma associated herpesvirus，KSHV）由Chang等［1］在1994年首先從AIDS相關(guān)型Kaposi′s肉瘤（Kaposi′s sarcoma，KS）患者的肉瘤組織發(fā)現(xiàn)，又稱 人 類8 型 皰 疹 病 毒（human herpesvirus-8，HHV-8）。KSHV 與原發(fā)性彌漫性淋巴瘤（primary effusion lymphoma，PEL）、多中心漿細(xì)胞增多癥（multicenter castleman′s disease，MCD）等惡性腫瘤發(fā)生密切相關(guān)［2］。此外，研究發(fā)現(xiàn)KSHV是卡波氏肉瘤發(fā)生的必需因素［3］。KS是一種少見的軟組織惡性多發(fā)性出血性血管肉瘤。臨床上分為4 型即經(jīng)典型KS、AIDS相關(guān)型KS、非洲型KS及免疫抑制型KS［4］，因此，KS為艾滋病患者好發(fā)腫瘤之一。來源于體腔B 淋巴細(xì)胞瘤的BCBL-1細(xì)胞攜帶KSHV。KSHV 在宿主細(xì)胞內(nèi)的復(fù)制周期分潛伏和裂解復(fù)制感染2個階段，其中，ORF65蛋白是病毒衣殼蛋白，在病毒裂解期表達(dá)并可誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生特異免疫應(yīng)答，并且在KSHV 6 種衣殼蛋白中與其他皰疹病毒同源性最低［5-6］。因此，ORF65 蛋白是KSHV 病毒檢測及其疫苗研究制備的靶抗原，是目前KSHV 研究前沿?zé)狳c之一。為獲得高效價的ORF65蛋白抗體，本研究利用ORF65蛋白，通過免疫家兔制備特異性免疫血清，并對其效價及與KSHV 結(jié)合的特異性進(jìn)行了鑒定。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞 KSHV 潛伏感染的BCBL-1細(xì)胞（南京醫(yī)科大學(xué)盧春教授饋贈）。

1.2 動物 健康日本大耳白兔，雌性，體質(zhì)量2.0～2.5kg，由右江民族醫(yī)學(xué)院實驗動物中心提供（批號：LX1304-A3）。

1.3 試劑與儀器 ORF65蛋白抗原肽［由英濰捷基（上海）貿(mào)易有限公司合成］序列：ASDILTTLSSTTETAAPAVADARKPPSGKKK。細(xì)胞培養(yǎng)基RPMI-1640 為Bio Whittaker Cambrex Company產(chǎn)品，胎牛血清為Gibco 公司產(chǎn)品，山羊抗兔IgG（H＋L）-HRP、IgG（H＋L）-Alexa fluor 488、發(fā)光蛋白購自Cell Signaling Technology，完全弗氏佐劑及不完全弗氏佐劑、OPD 底物、HRP-DAB底物顯色試劑盒購于天根試劑公司，細(xì)胞免疫染色固定液、抗熒光淬滅封片液、Western細(xì)胞裂解液、超敏ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒為碧云天產(chǎn)品，預(yù)染蛋白分子量標(biāo)準(zhǔn)為Ferments公司產(chǎn)品，其他試劑均為國產(chǎn)分析純產(chǎn)品。倒置相差顯微鏡（Leccia Microsystems CMS GmbH），酶聯(lián)免疫檢測儀（Berthold LB941），電熱恒溫水浴箱WH.W21.CU600（上海醫(yī)療器械七廠），激光共聚焦顯微鏡（FV-500奧林巴斯），ChemidocXRS型凝膠成像系統(tǒng)為美國Bio-Rad產(chǎn)品。

1.4 方法

1.4.1 家兔多克隆抗體的制備 選擇4只純種健康日本大耳白家兔，實驗前采集家兔血清，作為陰性對照，分別用合成的ORF65蛋白抗原肽進(jìn)行0、2、4、6周免疫程序皮內(nèi)、皮下多點注射免疫。初次免疫抗原肽與完全弗氏佐劑等量混合，再次免疫抗原肽與不完全弗氏佐劑等量混合、充分乳化，免疫劑量為每只2mg。同時，于第4次免疫后1周，取心臟血。收集的血液于4 ℃下靜置過夜，4 ℃下3 000r／min離心5min，取血清分裝，置于-20 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4.2 家兔血清中抗ORF65抗體的ELISA 檢測 用方陣滴定法確定包被抗原和血清的最適工作濃度，將包被抗原（ORF65）用pH9.6 的碳酸鹽 緩 沖液稀釋 為1.25、2.5、5.0、10.0μg／mL的溶液，取免疫血清及陰性血清各1 份，作1∶100、1∶200、1∶400、1∶800、1∶1 600、1∶3 200、1∶6 400、1∶12 800稀釋，ELISA 間接法檢測血清抗體效價［7］。測定450 nm 處抗體稀釋度均值（A 值），將450nm 處A 值為1.0左右的抗原包被濃度和血清稀釋度確定為抗原肽的最適包被濃度和血清最佳稀釋度［8］。

1.4.3 家兔免疫血清中抗ORF65抗體的間接免疫熒光檢測 調(diào)整BCBL-1細(xì)胞濃度至1×106個／mL，用無血清培養(yǎng)基同步化24h后，加含20ng／mL佛波酯（TPA）的完全培養(yǎng)基培養(yǎng)48h。收集細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度至2×106個／mL，離心涂片，用免疫染色固定液固定。0.1% PBS-T 洗滌3 次；用5%的BSA 37 ℃封閉30min，洗滌3次；分別加家兔ORF65免疫血清、免疫前兔血清，37 ℃孵育30 min，洗滌3 次；加山羊抗兔IgG（H＋L）-Alexa fluor 488，洗滌3次；PI染料染色5min，洗滌3次；用抗熒光淬滅封片液封片，鏡檢。

1.4.4 家兔免疫血清中抗ORF65抗體的Western blot檢測 用20ng／mL TPA 誘導(dǎo)BCBL-1細(xì)胞48h，使細(xì)胞中KSHV活化，同時以未加TPA 刺激的BCBL-1細(xì)胞為對照。收集各組BCBL-1細(xì)胞蛋白加入RIPA（強級）裂解液，4 ℃下16 000 r／min離心5min。取上清液，電泳考馬斯亮藍(lán)染色確定上樣量，分裝，-80 ℃保存。進(jìn)行12%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠（SDS-PAGE）電泳分離蛋白。轉(zhuǎn)膜后，室溫下用5%脫脂奶粉封閉1h，1×TBST 緩沖液漂洗3次；分別加免疫血清及β-Actin一抗，4 ℃下孵育過夜，洗膜3次；加辣根過氧化物酶標(biāo)記羊抗兔二抗孵育1h，洗膜3次；加化學(xué)發(fā)光試劑，于凝膠成像儀（chemidoc XRS，Bio-Rad，USA）中成像。

1.5 統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計量資料以±s表示，兩樣本均數(shù)間采用t檢驗分析，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 抗原和免疫血清的最適工作濃度 根據(jù)ELISA 方陣滴定法檢測的要求，選擇A 值在1.0左右時的抗原抗體濃度為最佳工作濃度，結(jié)果見表1、2。在接近A450＝1的組合中，得出最佳的工作濃度：抗原包被濃度為2.5 mg／L、抗體濃度為1∶6 400的組合。從抗原抗體最佳工作濃度的間接ELISA 法結(jié)果顯示，在抗體濃度為1∶12 800，抗ORF65免疫血清抗血清A 值為（0.656±0.024），陰性血清A 值為（0.075±0.023），差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01），說明血效價達(dá)1∶12 800以上，已成功制備ORF65的多克隆抗體。

表1 抗ORF65免疫血清最適工作濃度方陣滴定（±s）

表1 抗ORF65免疫血清最適工作濃度方陣滴定（±s）

＊：P＜0.01，與陰性對照組比較。

ORF65（μg／mL）A值陰性對照1∶100 1∶100 1∶200 1∶400 1∶800 1.25 1.233±0.036＊ 0.960±0.056＊ 0.888±0.025＊ 0.885±0.034＊0.293±0.031 2.5 1.376±0.023＊ 1.335±0.045＊ 1.282±0.041＊ 1.231±0.021＊ 0.282±0.021 5.0 1.223±0.033＊ 1.138±0.032＊ 0.933±0.047＊ 0.823±0.044＊ 0.369±0.038 10.0 0.908±0.039＊ 0.884±0.027＊ 0.812±0.033＊ 0.739±0.025＊0.291±0.046

表2 抗ORF65免疫血清最適工作濃度方陣滴定（±s）

表2 抗ORF65免疫血清最適工作濃度方陣滴定（±s）

＊：P＜0.05，△：P＜0.01，與陰性對照組比較。

ORF65（μg／mL）A值陰性對照1∶100 1∶100 1∶200 1∶400 1∶800 1.25 0.804±0.038△ 0.633±0.023△ 0.445±0.020＊0.364±0.019 0.293±0.031 2.5 1.182±0.042△ 1.085±0.028△ 0.998±0.033△ 0.656±0.024△ 0.282±0.021 5.0 0.761±0.025△ 0.604±0.027△ 0.318±0.026 0.218±0.029 0.369±0.038 10.0 0.609±0.024△ 0.325±0.033 0.267±0.035 0.184±0.039 0.291±0.046

2.2 免疫熒光法檢測ORF65蛋白表達(dá)及定位 陰性對照組顯示微弱的綠色熒光，而實驗組則顯示較強的綠色熒光，且綠色熒光較多地集中在細(xì)胞質(zhì)上，這說明ORF65 蛋白表達(dá)于BCBL-1細(xì)胞，并且表達(dá)于細(xì)胞質(zhì)上，見圖1。

圖1 間接免疫熒光檢測免疫血清對BCBL-1細(xì)胞中ORF65蛋白的免疫反應(yīng)性（×400）

2.3 蛋白質(zhì)免疫印跡法檢測ORF65 蛋白表達(dá) TPA 誘導(dǎo)BCBL-1細(xì)胞組及未加TPA 刺激的BCBL-1細(xì)胞對照組在21 kD 處均有特異性蛋白條帶，其大小與ORF65蛋白大小相符，且TPA 誘導(dǎo)BCBL-1細(xì)胞組蛋白表達(dá)量明顯高于未加TPA刺激的BCBL-1細(xì)胞對照組組，見圖2。

圖2 抗ORF65抗體特異性的Western blot鑒定

3 討 論

KSHV 是卡波氏肉瘤發(fā)生的必需因素，跟未發(fā)生KS 的KSHV 感染者比較，KS 患者體內(nèi)KSHV 的病毒載量含量較高，體內(nèi)含活化病毒的細(xì)胞數(shù)量與組織發(fā)生惡化及病毒感染的進(jìn)程有相應(yīng)關(guān)系；而且在疾病的發(fā)展進(jìn)程中病毒載量也隨之提高［9-10］。KSHV 處于潛伏感染狀態(tài)下的被重激活并裂解復(fù)制，此時可檢測到多種病毒裂解復(fù)制產(chǎn)物，復(fù)制相關(guān)基因ORF59、包裝相關(guān)基因ORF29、主要衣殼蛋白ORF26、包膜糖蛋白K8.1、小衣殼蛋白ORF65蛋白等，同時，KSHV 包裝產(chǎn)生新的感染性病毒顆粒［11-15］。其中，ORF65蛋白是在子代病毒的裝配中有重要作用，ORF65蛋白在細(xì)胞內(nèi)主要發(fā)揮轉(zhuǎn)運其他衣殼蛋白的功能，一旦ORF65蛋白缺失，病毒會發(fā)生衣殼缺失。因此，ORF65蛋白可作為檢測KSHV 感染的一個重要的免疫學(xué)指標(biāo)，也可以作為一個新的抗病毒靶點。

抗原抗體反應(yīng)具有比例性，如果抗原抗體的濃度和比例適合則形成的復(fù)合物體體積大、數(shù)量多。如包被抗原濃度過高，由于蛋白質(zhì)與酶標(biāo)板的聚苯乙烯分子間的相互作用，蛋白質(zhì)容易吸附于酶標(biāo)板表面，可能產(chǎn)生前帶現(xiàn)象而降低敏感性。如果包被液中的抗原濃度過低，固相載體（酶標(biāo)板）表面不能被完全覆蓋，酶標(biāo)板孔表面容易非特異性吸附相繼加入的一抗血清標(biāo)本和二抗中的蛋白質(zhì)，產(chǎn)生非特異性顯色而影響檢測結(jié)果，因此，在ELISA 方陣滴定法中接近A450＝1的組合中，得出最佳的抗原抗體工作濃度［7］。另外，在抗ORF65免疫血清濃度為1：12 800，抗血清A 值為0.656±0.024，陰性清A 值為0.075±0.023，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）。在進(jìn)一步的免疫熒光檢測實驗中，用免疫血清可以檢測到TPA 誘導(dǎo)活化的KSHV 感染的BCBL-1細(xì)胞顯示較強的綠色熒光；用Western blot則可以檢測到TPA 刺激與未刺激的BCBL-1 細(xì)胞中，TPA 刺激的BCBL-1細(xì)胞中病毒衣殼蛋白ORF65的表達(dá)量較高，該抗血清具有特異性。因此，推斷本研究獲得了高效價的抗ORF65家兔免疫血清。

本研究成功制備KSHV ORF65多克隆抗體，該結(jié)果為進(jìn)一步制備ORF65單克隆抗體奠定了基礎(chǔ)?；贠RF65蛋白在KSHV 復(fù)制中的重要作用，成功制備該抗體也為進(jìn)一步研究臨床KSHV 感染檢測方法和探索抗病毒新靶點的研究奠定基礎(chǔ)。

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