鐘慧芝，呂福通，謝丹尼，莫 毅，林發(fā)全△

（1.廣西醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院檢驗(yàn)科，南寧530021；2.廣西壯族自治區(qū)人口和計(jì)劃生育研究中心，南寧530021）

男性精子遺傳物質(zhì)的完整性對(duì)于自然受孕及其胚胎的正常發(fā)育起著重要作用。精子DNA 損傷過高與不明原因的反復(fù)流產(chǎn)有關(guān)，而且還會(huì)增加子代患不育癥的風(fēng)險(xiǎn)［1］。男性不育患者精子DNA 損傷程度比健康男性的更為顯著［2］。為此，人類精子DNA 損傷機(jī)制及其不良影響成為生殖醫(yī)學(xué)領(lǐng)域關(guān)注的熱點(diǎn)問題之一；并且在輔助生殖治療過程中，男性不育患者精子DNA 損傷程度已被作為一項(xiàng)重要參考指標(biāo)納入治療前精子質(zhì)量評(píng)價(jià)及對(duì)患者生育能力進(jìn)行預(yù)測［3］。目前，國內(nèi)外的臨床研究主要應(yīng)用以下幾種方法檢測精子DNA 損傷，如單向凝膠電泳（single cell gel electropherosis，SCGE）實(shí)驗(yàn)、末端標(biāo)記檢測（TUNEL assay）、精子染色質(zhì)結(jié)構(gòu)分析（SCSA）和染色質(zhì)擴(kuò)散試驗(yàn)（SCD）等。然而，在臨床和科研過程中，對(duì)此尚缺乏規(guī)范和統(tǒng)一的檢測方法和標(biāo)準(zhǔn)，并且相關(guān)研究結(jié)論亦存在分歧。因此，有必要尋找一種新的標(biāo)志物對(duì)精子DNA 損傷進(jìn)行檢測，建立一套準(zhǔn)確評(píng)價(jià)精子DNA 損傷程度的標(biāo)準(zhǔn)。

γH2AX 是由組蛋白H2A 家族中H2AX 磷酸化所形成。有研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)細(xì)胞的DNA 受到損傷時(shí)，尤其是DNA 雙鏈斷裂（DSBs）損傷后，在DSBs位點(diǎn)會(huì)出現(xiàn)γH2AX 形成的“焦點(diǎn)”結(jié)構(gòu)，執(zhí)行DNA 損傷的感受或修復(fù)功能。另外，人們發(fā)現(xiàn)γH2AX 焦點(diǎn)的形成沒有細(xì)胞特異性，無論何種因素誘導(dǎo)產(chǎn)生的DSBs都會(huì)伴隨有H2AX 的磷酸化，并且γH2AX 形成焦點(diǎn)的數(shù)量及損傷引起的DSBs數(shù)量基本上是1∶1的關(guān)系。這表明γH2AX 可作為DNA 損傷的標(biāo)志，是目前檢測體細(xì)胞DNA損傷，特別是DSBs的一個(gè)新的特異性指標(biāo)［4-5］。然而，γH2AX在男性不育患者精子的檢測及與DSBs的相關(guān)研究較少。因此，本研究運(yùn)用SCGE、流式細(xì)胞術(shù)等方法對(duì)健康男性、男性不育患者的精子DSBs損傷程度和γH2AX 含量進(jìn)行測定和比較，并通過PureSperm 密度梯度離心法（DGC）對(duì)精子進(jìn)行優(yōu)選，再次檢測2個(gè)指標(biāo)的前后變化，旨在探討γH2AX 用于評(píng)價(jià)男性不育患者精子DNA DSBs損傷程度的可行性，為輔助生殖技術(shù)進(jìn)一步獲得良好結(jié)局提供理論依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 一般資料 本研究選取2012年11月至2013年1月就診于廣西醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院生殖醫(yī)學(xué)研究中心、男性科門診確診為男性不育患者27例精液樣本作為病例組研究對(duì)象設(shè)為男性不育組，另外選取23例確認(rèn)有生育能力的健康志愿者的精液樣本作為對(duì)照組。本研究的男性不育的納入標(biāo)準(zhǔn)：（1）男性不育患者均在未避孕、排除女方原因的條件下婚后2年未懷孕；（2）患者性激素檢測正常；（3）患者在過去的3個(gè)月內(nèi)未進(jìn)行藥物或手術(shù)治療；（4）精液量大于2mL，精子密度大于20×106，精子活率大于20%，且抗精子抗體檢查陰性。所有研究對(duì)象在采集精液標(biāo)本之前均禁欲3～7d；以手淫法收集精液并用潔凈無菌試管收集，立即放入37 ℃水浴箱內(nèi)使其自然液化。

1.2 主要試劑（盒）與儀器 40%puresperm 液、80%puresperm 液、Puresperm wash 液（Nidacon Internal AB 公 司），鼠抗人FITC anti-H2AX-Phosphorylated（Ser139）、兔抗鼠FITC anti-H2AX-Phosphorylated同型對(duì)照（美國BioLegend公司），蛋白酶K、多聚甲醛（美國Sigma-Aldrich公司），正常熔點(diǎn)瓊脂糖、低熔點(diǎn)瓊脂糖（西班牙Biosharp公司），鹽酸（廉江市愛廉化工試劑有限公司）、二甲基亞砜（DMSO）、氯化鈉、硼酸、NaOH（天津市博迪化工有限公司），二（羥甲基）氨基甲烷（Tris-Base）、Triton-X 100（廣州威佳科技有限公司），精液分析儀，AX70Olympus熒光顯微鏡，BD 流式細(xì)胞儀器（美國BD FACSC cantoTM Ⅱ），水平電泳槽。

1.3 精子γH2AX 的檢測 先將已經(jīng)液化的精液混勻，以PBS緩沖液將精子濃度調(diào)整至（5×106～1×107）／mL 后，用4%的多聚甲醛固定15min。再用PBS緩沖液，300×g離心精子5min，去除上清液留下底部沉淀物。隨后加入0.5%的Triton-X 100，吹散并混勻沉淀物，破膜15min。再次加入適量的PBS緩沖液，以300×g的離心力離心破膜后的精子5min，去除上清液留下底部沉淀物。再加入PBS緩沖液，300×g離心精子5 min，去除上清液。再向標(biāo)本中加入20μL 鼠抗人γH2AX 單克隆抗體，用加樣槍輕輕吹打混勻，室溫避光孵育30min。用PBS緩沖液洗滌2次并且要在避光條件下處理，最后上流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測。同型對(duì)照的處理除所加抗體不同（加入的抗體為兔抗鼠γH2AX 單克隆抗體）外，其余處理步驟同上。

1.4 SCGE實(shí)驗(yàn)

1.4.1 制做凝膠玻片 先將代用樣本混勻，將精子濃度調(diào)整至1×107／mL。吸取100μL 0.65%正常熔點(diǎn)瓊脂糖平鋪于預(yù)先處理好的載玻片上，并快速地蓋上蓋玻片，置于4 ℃環(huán)境中10min，使瓊脂糖充分凝固。再將預(yù)先配好的0.65%低熔點(diǎn)瓊脂糖進(jìn)行熔解，待其完全熔解后，放在室溫下使其溫度稍稍下降后吸取75μL 瓊脂糖液與15μL 預(yù)先調(diào)配好濃度的精子混勻。在第1層瓊脂糖凝膠均勻地鋪上調(diào)配好的精子瓊脂糖混合液，置于4 ℃環(huán)境中10min，使瓊脂糖充分凝固。最后待第2層瓊脂糖凝膠完全凝固后，再鋪上75μL 0.65%低熔點(diǎn)瓊脂糖，置于4 ℃環(huán)境中10min，使瓊脂糖充分凝固。

1.4.2 凝膠玻片的裂解與電泳 將制好的瓊脂糖凝膠玻片放入預(yù)先配好的中性裂解液中，在4℃環(huán)境中裂解2h，將瓊脂糖凝膠玻片從中性裂解液中取出，先浸泡在PBS液30s，此步驟重復(fù)3次，再將瓊脂糖凝膠玻片放入裂解液2中，將其放入37℃水浴箱內(nèi)繼續(xù)裂解15h，將裂解好的瓊脂糖凝膠玻片再用PBS液浸泡30s，再放入盛有TBE 電泳液的電泳槽中平衡20 min，然后在15V、100mA 的電場下電泳60min，并在4 ℃和避光環(huán)境中進(jìn)行。將電泳好的瓊脂糖凝膠玻片放入中和液中進(jìn)行中和。將中和好的瓊脂糖凝膠玻片進(jìn)行溴化乙錠（EB）染色，EB稀釋比例為1∶2 000，吸取調(diào)配好的EB液20μL，均勻地鋪在瓊脂糖凝膠玻片上等待20s，吸去多余的EB，將染好EB的瓊脂糖凝膠玻片置于熒光顯微鏡下觀察。

1.5 puresperm 密度梯度離心優(yōu)選精子 吸取80% puresperm 液1.5 mL 移至無菌錐形離心管底部，再吸取40%puresperm 液1.5mL，輕輕加至80%puresperm 液上，使2種不同濃度的puresperm 液出現(xiàn)清晰的分界面。再將1.0mL精液標(biāo)本輕輕加至40% puresperm 液上，使精液與40% puresperm 液也出現(xiàn)清晰的分界面。用350×g離心20 min，保留沉淀物及4～6mm 高的80%puresperm 液。再用puresperm wash液對(duì)標(biāo)本進(jìn)行洗滌，以350×g離心10 min。吸去上清液，留取沉淀，再向沉淀物中加入少許puresperm wash液，混勻放置37 ℃水浴箱保溫。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 17.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析處理。計(jì)量資料以±s表示，兩組比較，符合方差齊時(shí)用t檢驗(yàn)分析，不符合時(shí)用秩和檢驗(yàn)，計(jì)數(shù)資料比較用χ2檢驗(yàn)，等級(jí)資料用秩和檢驗(yàn)，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 優(yōu)選前兩組精液常規(guī)參數(shù)的比較 本實(shí)驗(yàn)運(yùn)用CASA對(duì)兩組精液進(jìn)行精液常規(guī)分析，結(jié)果見表1。兩組精液在年齡、精液液化時(shí)間、精液量等方面比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），但在精子濃度、精子活率、前向運(yùn)動(dòng)精子百分率以及正常形態(tài)百分率上，對(duì)照組均高于男性不育組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。

表1 優(yōu)選前兩組精液常規(guī)參數(shù)的比較（±s）

表1 優(yōu)選前兩組精液常規(guī)參數(shù)的比較（±s）

變量 對(duì)照組（n＝23）男性不育組（n＝27）P年齡（歲）30.83±4.02 32.74±4.39 0.094精液量（mL） 3.93±0.98 4.16±1.07 0.644濃度（×106／mL） 77.49±16.73 56.73±35.82 0.012精子活率（%） 56.73±9.71 45.30±11.89 0.002前向運(yùn)動(dòng)精子（%） 49.99±8.96 35.59±11.01 0.000精子正常形態(tài)率（%）27.82±2.97 15.26±1.87 0.000

2.2 兩組精液γH2AX 百分含量的測定結(jié)果比較 通過流式細(xì)胞儀對(duì)兩組優(yōu)選前精液進(jìn)行γH2AX 含量的測定，結(jié)果顯示男性不育組精子中表達(dá)的γH2AX 為（23.87±4.34）%，明顯高于對(duì)照組的（13.8±2.88）%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。如圖1所示，“門”左側(cè)為陰性表達(dá)精子γH2AX，“門”右側(cè)為陽性表達(dá)精子γH2AX。

2.3 兩組精液單向凝膠電泳實(shí)驗(yàn)的結(jié)果比較 SCGE 也稱彗星實(shí)驗(yàn)，臨床上常用堿性彗星實(shí)驗(yàn)檢測DSBs。彗星實(shí)驗(yàn)指標(biāo)有多種，其中尾部DNA 百分含量是公認(rèn)的能夠反映DNA 損傷程度的可靠指標(biāo)，通過Casp軟件可直接計(jì)算出彗尾中DNA百分含量。根據(jù)彗星尾部DNA 百分含量可將精子細(xì)胞核DNA 損傷程度分為5個(gè)等級(jí)，見圖2（本研究無4級(jí)精子損傷，故無4級(jí)精子損傷圖片）。0級(jí)：＜5%，為無損傷精子，精子核完整；1級(jí)：5%～20%，為輕度損傷精子，可見彗尾，精子核縮小；2級(jí)：21%～40%，中度損傷精子，可見明顯慧尾，精子核縮?。?級(jí)：41%～95%，重度損傷精子，彗尾熒光信號(hào)強(qiáng)而密，并見明顯縮小的精子核；4級(jí)：＞95%，完全損傷的精子，僅見強(qiáng)而密的熒光彗尾，精子核基本消失。通過Casp軟件對(duì)兩組優(yōu)選前精液精子彗星圖像進(jìn)行觀察和分析，結(jié)果顯示，對(duì)照組中無DNA 損傷的精子為1 835個(gè)，輕度損傷的精子為390個(gè)，中度損傷為75個(gè)，未發(fā)現(xiàn)DNA 重度損傷及完全損傷精子；男性不育組無DNA 損傷的精子為1 825個(gè)，輕度損傷的精子為719個(gè)，中度損傷為132個(gè)，重度損傷為24個(gè)，未發(fā)現(xiàn)DNA 完全損傷精子。兩組精子DNA 雙鏈損傷程度進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，結(jié)果顯示對(duì)照組精子DNA 雙鏈損傷程度顯著低于男性不育組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），見表2。

圖1 γH2AX 的流式細(xì)胞示意圖

圖2 精子細(xì)胞核DNA 損傷程度等級(jí)圖（×400）

表2 兩組精子DNA 雙鏈損傷程度比較（個(gè)）

2.4 經(jīng)密度梯度離心法優(yōu)選后兩組精液γH2AX 百分含量和單向凝膠電泳結(jié)果比較 對(duì)兩組優(yōu)選后的精液進(jìn)行精子γH2AX 含量的測定，并與優(yōu)選前各組精液的精子γH2AX 含量進(jìn)行比較。結(jié)果顯示，優(yōu)選后兩組精子的γH2AX 含量與優(yōu)選前各組精液的精子γH2AX 含量比較均顯著降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），見表3、圖3。通過觀察單向凝膠電泳結(jié)果，經(jīng)過puresperm DGC 優(yōu)選后的兩組精液，其彗尾中DNA的百分含量與優(yōu)選前各組精液比較均顯著減少，見圖3；優(yōu)選后的兩組精液的精子DNA 雙鏈損傷百分率均減少，與各組優(yōu)選前的單向凝膠電泳結(jié)果比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），見表4、圖4。

圖3 精液優(yōu)選前、后γH2AX 百分含量的比較

圖4 精液優(yōu)選前、后精子細(xì)胞核DNA 損傷程度比較圖（×400）

表3 兩組精液優(yōu)選前、后精子γH2AX 百分 含量的比較（±s，%）

表3 兩組精液優(yōu)選前、后精子γH2AX 百分 含量的比較（±s，%）

組別 n 優(yōu)選前 優(yōu)選后P 23 13.80±2.88 8.77±2.28 0.000男性不育組對(duì)照組27 23.87±4.34 14.98±2.02 0.000

表4 兩組精液優(yōu)選前、后DNA 損傷百分率比較（個(gè)）

3 討 論

眾所周知，高質(zhì)量的精子與卵子是受孕成功的重要因素。但在通常情況下，男性不育患者的精子質(zhì)量比健康男性的精子質(zhì)量低下，使得夫婦雙方不能通過正常的性行為使女方自然懷孕。國內(nèi)外大量的臨床試驗(yàn)研究證實(shí)，男性不育患者的精子密度、精子活率、前向運(yùn)動(dòng)精子百分率、精子正常形態(tài)百分率以及線粒體膜電位（mitochondrial membrane potential，MMP）都顯著低于健康男性［6］。本研究也得出類似結(jié)果。

造成男性不育的因素很多，而精子DNA 損傷是其中一個(gè)重要因素。已有大量研究表明精子DNA 損傷程度與受孕率及其胚胎質(zhì)量呈負(fù)相關(guān)［7-11］。此外，有研究表明使用有DNA損傷精子進(jìn)行輔助生殖技術(shù)將會(huì)增加子代患不育癥的可能性以及某些遺傳方面的疾病，并且男性不育患者精液中精子DNA 損傷比例顯著高于健康男性［12-13］。因此，本實(shí)驗(yàn)選擇男性不育患者精子進(jìn)行DSBs的檢測。γH2AX 焦點(diǎn)檢測方法已開始用于檢測各種化學(xué)、物理等因素所誘導(dǎo)的體細(xì)胞DSBs［14］。研究發(fā)現(xiàn)在人類精子細(xì)胞DNA 損傷過程中同樣伴隨γH2AX 的出現(xiàn)，并且γH2AX 水平與生殖毒性物質(zhì)H2O2或者阿霉素之間呈現(xiàn)明顯的劑量-時(shí)間效應(yīng)，認(rèn)為γH2AX 焦點(diǎn)可以作為生殖毒性物質(zhì)引發(fā)精子DNA 損傷的特異、敏感指標(biāo)。本研究運(yùn)用流式細(xì)胞儀對(duì)健康男性和男性不育患者的精子進(jìn)行γH2AX 含量測定，觀察兩組的γH2AX 含量是否有差異，同時(shí)運(yùn)用密度梯度離心法和單向凝膠電泳對(duì)兩組精液的精子進(jìn)行優(yōu)選和DNA 雙鏈損傷程度的檢測，用于驗(yàn)證γH2AX的出現(xiàn)與精子DNA 雙鏈損傷有關(guān)。研究結(jié)果顯示，健康男性中精子γH2AX 的表達(dá)含量顯著低于男性不育患者，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。運(yùn)用堿性SCGE檢測精子DNA 雙鏈損傷程度，結(jié)果也顯示健康男性精液中DNA 損傷精子程度顯著低于男性不育患者。通過密度梯度離心法對(duì)兩組精子進(jìn)行優(yōu)選，兩組精子的DNA 雙鏈損傷的精子顯著減低，與優(yōu)選前比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。這一結(jié)果與國內(nèi)外有關(guān)精子優(yōu)選研究結(jié)果相似。國內(nèi)外研究顯示，經(jīng)過密度梯度離心法優(yōu)選后的精子能有效去除DNA 損傷的精子［15］。與單向凝膠電泳實(shí)驗(yàn)相類似，兩組精子在經(jīng)過密度梯度離心法優(yōu)選后，γH2AX 表達(dá)的精子也顯著減低，且與優(yōu)選前比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。這一結(jié)果說明密度梯度離心法能有效去除γH2AX 表達(dá)的精子。

密度梯度離心法優(yōu)選精子的原理是利用在離心時(shí)，活力好的精子能更好地沿沉淀梯度的方向運(yùn)動(dòng)，迅速穿越不同密度的液體界面，從而自行與死精子、凝集精子、白細(xì)胞以及雜質(zhì)分離，達(dá)到優(yōu)選精子的目的。有研究表明精子DNA 損傷程度與精子前向運(yùn)動(dòng)呈負(fù)相關(guān)。當(dāng)有DNA 雙鏈損傷時(shí)，DNA 斷裂處便會(huì)有γH2AX 焦點(diǎn)的表達(dá)。因此，運(yùn)用密度梯度心離法可以有效地去除DNA 損傷的精子以及γH2AX 表達(dá)的精子；但是，該優(yōu)選方法仍然存在不足之處，它未能有效地去除早期γH2AX 表達(dá)的精子，因?yàn)楫?dāng)精子出現(xiàn)早期DNA 損傷時(shí)，精子的活力及前向性運(yùn)動(dòng)很可能在正常范圍，這樣就有可能不能有效地去除早期γH2AX 表達(dá)的精子。因此，尋找出一種新的優(yōu)選方法篩選出早期DNA 損傷的精子，仍是生殖醫(yī)學(xué)領(lǐng)域關(guān)注的熱點(diǎn)問題之一。

在臨床上，SCGE已經(jīng)廣泛用于檢測各種細(xì)胞的DNA 損傷，但是，存在耗時(shí)較長、操作繁瑣、溫度控制較為嚴(yán)格等缺點(diǎn)，在操作過程中還很容易造成DNA 的再次損傷，因此，操作要格外小心。相比于運(yùn)用流式細(xì)胞儀測定γH2AX 用于檢測DNA 損傷，其耗時(shí)短、操作簡便、結(jié)果客觀、易于觀察，同時(shí)運(yùn)用抗原抗體結(jié)合原理，增加了檢測DNA 損傷的靈敏度和準(zhǔn)確度，并且在細(xì)胞雙鏈DNA 斷裂早期即可出現(xiàn)γH2AX，使得有雙鏈DNA 斷裂的細(xì)胞能在早期被檢測出來。

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