肖　軍,黎　立,姜振宇,史迎昌,孫佳增,劉維全,孫慧娜,陶耀兵

(1.解放軍第三○九醫(yī)院 a.心內(nèi)科,b.動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心，北京新技術(shù)公司100091; 2.中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)生物學(xué)院，北京 100091)

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缺血后處理對(duì)大鼠心肌缺血/再灌注不同時(shí)相損傷營(yíng)救激酶及線粒體通透性轉(zhuǎn)換孔的影響

肖軍1a,黎立1b※,姜振宇1b,史迎昌1b,孫佳增2,劉維全2,孫慧娜1a,陶耀兵1a

(1.解放軍第三○九醫(yī)院 a.心內(nèi)科,b.動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心，北京新技術(shù)公司100091; 2.中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)生物學(xué)院，北京 100091)

再灌注治療是挽救缺血心肌細(xì)胞的最有效方法，但同時(shí)也可導(dǎo)致再灌注損傷[1]。2003年，Zhao等[2]進(jìn)行犬實(shí)驗(yàn)并提出缺血后處理的概念：在冠狀動(dòng)脈再灌注開(kāi)始時(shí)實(shí)行短暫、重復(fù)的開(kāi)通及再閉(冠狀動(dòng)脈3輪30 s阻塞/30 s再灌注)，隨后恢復(fù)冠狀動(dòng)脈血流，對(duì)改善心肌再灌注損傷有益。研究證實(shí)，缺血后處理的心肌保護(hù)作用與其抑制線粒體通透性轉(zhuǎn)換孔(mitochondrial permeability transition pore,mPTP)開(kāi)放和激活再灌注損傷營(yíng)救激酶途徑有關(guān)[3]。本研究應(yīng)用近交系Lewis大鼠頸部異位心臟移植左心作功心肌梗死模型，探討缺血后處理對(duì)大鼠移植心臟心肌缺血/再灌注不同時(shí)相再灌注損傷營(yíng)救激酶途徑與mPTP的影響。

1材料與方法

1.1大鼠頸部異位心臟移植左室作功模型制備供受者Lewis大鼠240只(健康雄性近交系，RT-11,合格證號(hào)：SCXK-2012-0004,無(wú)特定病原體動(dòng)物級(jí)，體質(zhì)量250～300 g,鼠齡 8～10周，由解放軍總參總醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供)。供心主動(dòng)脈與受體右頸總動(dòng)脈的單線連續(xù)端側(cè)吻合，供心右上腔靜脈與受體右頸外靜脈的單線連續(xù)端端吻合，供心主肺動(dòng)脈與左心耳行端側(cè)吻合[4-5]。

1.2動(dòng)物分組及處理120只受體大鼠存活2 d后，肌內(nèi)注射速眠新(8 mL/kg)全身麻醉。采用隨機(jī)數(shù)字表法分為移植心臟缺血/再灌注組、缺血后處理組和假手術(shù)組，其中假手術(shù)組8只大鼠，其余兩組分別為56只，每個(gè)時(shí)相點(diǎn)8只。①缺血/再灌注組(再灌注3、6、12、24 h及2、4、7 d)：用無(wú)損傷針在移植心左冠前降支下(以左冠狀動(dòng)脈主干為標(biāo)志，在左心耳部下方2 mm處進(jìn)針，3-0絲線穿過(guò)心肌表層在肺動(dòng)脈圓錐旁出針)穿線并通過(guò)內(nèi)徑1 mm的乳膠管，收緊線完全阻斷左冠狀動(dòng)脈前降支30 min，松解線使血管得到充分再灌注。②缺血后處理組(再灌注3、6、12、24 h及2、4、7 d)：在再灌注前1 min內(nèi)，迅速給予短暫再通10 s，隨之再次阻斷10 s，此為1個(gè)循環(huán)，重復(fù)3個(gè)循環(huán)，共計(jì)60 s的后處理循環(huán)。③假手術(shù)組(假手術(shù)24 h)：穿線做套環(huán)，但不收緊結(jié)扎線。1-0絲線單層關(guān)閉切口。術(shù)后每日肌內(nèi)注射青霉素(2萬(wàn)U/kg)和鏈霉素(15 mg/kg)預(yù)防感染共3 d。單籠飼養(yǎng)，每日觀察大鼠精神狀態(tài)，通過(guò)視診和觸診觀察移植心臟的搏動(dòng)情況。

1.3心肌梗死范圍的測(cè)定經(jīng)主動(dòng)脈逆行灌注0.5% Evan′s藍(lán)2～3 mL，游離左心室稱(chēng)重，將無(wú)藍(lán)染缺血心肌以濾紙吸干后稱(chēng)重，置于-20 ℃冰凍20 min，將冰凍心臟從心尖至心底橫向切成薄片(每片厚度1 mm)5～6片，并浸入37 ℃ 1%氯化三苯基四氮唑磷酸鹽緩沖液(pH 7.4)中孵化30 min。壞死區(qū)呈灰白色，非壞死區(qū)呈深紅色，梗死范圍以壞死心肌重量與缺血心肌重量之比表示。

1.4磷酸化蛋白激酶B/蛋白激酶B(phosphorylation of protein kinase B/AKT，p-AKT)與細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶1/2(extracellular signal-regulated kinase 1/2,p-ERK1/2)蛋白表達(dá)檢測(cè)磷酸化蛋白激酶B/AKT、p-ERK1/2用Western blot法，參照文獻(xiàn)[6]。

1.5mPTP開(kāi)放程度檢測(cè)用分光光度計(jì)法，參照文獻(xiàn)[6]。用ΔA=ΔA1-ΔA2表示mPTP開(kāi)放程度，ΔA越小，mPTP開(kāi)放程度越大。

2結(jié)果

2.1心肌梗死范圍在再灌注7個(gè)時(shí)相點(diǎn)，缺血后處理組心肌梗死范圍均顯著低于相同時(shí)間點(diǎn)缺血/再灌注組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05或P<0.01),見(jiàn)表1。

表1　兩組大鼠再灌注不同時(shí)相心肌梗死范圍的比較　±s，n=8，%)

2.2心肌細(xì)胞p-AKT、p-ERK1/2蛋白表達(dá)假手術(shù)組心肌細(xì)胞p-AKT、p-ERK1/2蛋白表達(dá)水平分別為(0.44±0.04)和(0.61±0.10)，在再灌注7個(gè)時(shí)相點(diǎn)，缺血后處理組和缺血/再灌注組心肌細(xì)胞p-AKT、p-ERK1/2蛋白表達(dá)顯著高于假手術(shù)組(均P<0.01)。在再灌注7個(gè)時(shí)相點(diǎn)，缺血后處理組心肌細(xì)胞p-AKT、p-ERK1/2蛋白表達(dá)明顯高于相同再灌注時(shí)間的缺血/再灌注組(P<0.05)，缺血/再灌注組與缺血后處理組的心肌細(xì)胞p-AKT、p-ERK1/2蛋白表達(dá)峰值時(shí)間在再灌注24 h。見(jiàn)表2。

2.3心肌細(xì)胞mPTP開(kāi)放程度假手術(shù)組心肌細(xì)胞線粒體吸光度ΔA為(0.63±0.02)，在再灌注7個(gè)時(shí)相點(diǎn)，缺血后處理組和缺血/再灌注組心肌細(xì)胞線粒體吸光度ΔA著顯低于假手術(shù)組(均P<0.01)。在再灌注7個(gè)時(shí)相點(diǎn)，缺血后處理組心肌細(xì)胞線粒體吸光度ΔA著顯高于相同再灌注時(shí)間的缺血/再灌注組(P<0.01)，缺血再灌注組與缺血后處理組的心肌細(xì)胞線粒體吸光度ΔA峰值時(shí)間在再灌注24 h。見(jiàn)表2。

表2　兩組大鼠再灌注不同時(shí)相數(shù)據(jù)比較　±s，n=8)

p-ERK1/2：細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶1/2;p-AKT：磷酸化蛋白激酶B/AKT；缺血后處理組和缺血/再灌組各時(shí)相間比較及與假手術(shù)組比較，均P<0.05；“-”未檢測(cè)

3討論

20世紀(jì)80年代中期，Murry等[7]提出心肌在經(jīng)受多次短暫缺血/再灌注后，能在隨后的長(zhǎng)時(shí)間缺血中延遲并減輕心肌損傷，即缺血預(yù)處理。Marber等[8]的實(shí)驗(yàn)在缺血預(yù)處理研究史上是一個(gè)重大突破，發(fā)現(xiàn)由缺血刺激引發(fā)兩個(gè)不同保護(hù)窗,第一個(gè)保護(hù)窗在缺血預(yù)處理后即可產(chǎn)生，并于2～3 h后逐漸減弱，取而代之的第二保護(hù)窗(保護(hù)強(qiáng)度弱于第一窗)于12～24 h開(kāi)始出現(xiàn)，并持續(xù)2～3 d。2003年，Zhao等[2]在犬冠狀動(dòng)脈再灌注實(shí)行短暫(開(kāi)閉各30 s)、重復(fù)(3次)的開(kāi)通及再閉，隨后恢復(fù)冠狀動(dòng)脈血流，可減少約44%的心肌梗死面積，減少心肌水腫，減少中性粒細(xì)胞的聚集，減少細(xì)胞凋亡和改善內(nèi)皮細(xì)胞，提出了缺血后處理的概念[9]。目前研究認(rèn)為，缺血后處理的心肌保護(hù)機(jī)制與缺血預(yù)處理相似，但是兩者有明顯不同，預(yù)缺血處理在心肌缺血之前，缺血后處理在心肌梗死后。對(duì)于缺血后處理的認(rèn)識(shí)遠(yuǎn)沒(méi)有對(duì)于缺血預(yù)處理的認(rèn)識(shí)清楚，大多數(shù)文獻(xiàn)報(bào)道缺血后處理對(duì)缺血/再灌注的心肌保護(hù)作用局限于心肌再灌注6 h內(nèi)。Mykytenko等[10]比較再灌注24 h與3 h的心肌梗死范圍，發(fā)現(xiàn)后處理在再灌注晚期(24 h)仍具有縮小心肌梗死面積作用，但并未進(jìn)行系列時(shí)間節(jié)點(diǎn)的比較，也未對(duì)機(jī)制進(jìn)行深入探索。

本研究應(yīng)用近交系Lewis大鼠頸部異位心臟移植左心作功心肌梗死模型，移植心臟相當(dāng)于在體的Langendorff模型，解決了傳統(tǒng)在體模型動(dòng)物死亡率較高的問(wèn)題，也保證了(冠狀動(dòng)脈被結(jié)扎)移植心臟得到長(zhǎng)期較好的灌注，同時(shí)避免了移植心臟左心萎縮和血栓。本實(shí)驗(yàn)供受者為近交系Lewis大鼠，屬同基因心臟移植，因而沒(méi)有免疫排斥反應(yīng)問(wèn)題。本研究動(dòng)態(tài)觀測(cè)大鼠移植心臟心肌梗死范圍、心肌細(xì)胞p-AKT、p-ERK1/2蛋白表達(dá)及心肌細(xì)胞mPTP開(kāi)放程度在不同再灌注時(shí)間點(diǎn)的數(shù)值。在再灌注時(shí)間3、6、12、24 h及2、4、7 d，與假手術(shù)組比較，缺血/再灌注組和缺血后處理組心肌細(xì)胞p-AKT、p-ERK1/2蛋白表達(dá)顯著增高(P<0.01)，心肌細(xì)胞mPTP開(kāi)放程度增高(P<0.01)，提示再灌注損傷營(yíng)救激酶途徑及心肌細(xì)胞mPTP開(kāi)放在心肌缺血/再灌注損傷中起重要作用。與缺血/再灌注組比較，缺血后處理組在7個(gè)時(shí)相點(diǎn)的心肌細(xì)胞p-AKT、p-ERK1/2蛋白表達(dá)顯著增高(P<0.05)，心肌細(xì)胞mPTP開(kāi)放程度降低(P<0.01)，心肌梗死范圍顯著縮小(P<0.05)，提示缺血后處理能在再灌注早期(3 h)升高心肌細(xì)胞p-AKT、p-ERK1/2蛋白的表達(dá)，有效抑制心肌細(xì)胞mPTP開(kāi)放，有效縮小心肌梗死范圍，并持續(xù)到再灌注晚期(7 d)。缺血/再灌注組與缺血后處理組的心肌細(xì)胞p-AKT、p-ERK1/2蛋白表達(dá)峰值時(shí)間和心肌細(xì)胞mPTP開(kāi)放程度谷值時(shí)間在再灌注24 h，提示缺血后處理不能改變心肌細(xì)胞p-AKT、p-ERK1/2蛋白的表達(dá)達(dá)峰時(shí)間及mPTP開(kāi)放程度達(dá)谷時(shí)間。本研究表明，缺血后處理能減輕心肌缺血/再灌注損傷的程度，但不能改變(加速或延遲)心肌缺血/再灌注損傷的進(jìn)程。

缺血后處理是近年來(lái)國(guó)際上提出的心肌保護(hù)全新理念，作為一種內(nèi)源性心肌保護(hù)機(jī)制具有重大的研究?jī)r(jià)值和應(yīng)用價(jià)值。本研究提示，缺血后處理在大鼠心肌缺血/再灌注3 h～7 d內(nèi)能有效升高心肌細(xì)胞p-AKT、p-ERK1/2蛋白的表達(dá)，有效抑制心肌細(xì)胞mPTP開(kāi)放，有效縮小心肌梗死范圍。缺血后處理對(duì)心肌缺血/再灌注損傷的這種持續(xù)保護(hù)作用應(yīng)受到重視，其機(jī)制有待深入研究。

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摘要：目的探討缺血后處理對(duì)大鼠心肌缺血/再灌注不同時(shí)相損傷營(yíng)救激酶及線粒體通透性轉(zhuǎn)換孔(mPTP)的影響。方法建立近交系Lewis大鼠頸部異位心臟移植左心作功模型， 120只受體大鼠存活2 d后，采用隨機(jī)數(shù)字表法分為移植心臟缺血/再灌注組、缺血后處理組和假手術(shù)組，其中假手術(shù)組8只，其余兩組分別為56只，每個(gè)時(shí)相點(diǎn)8只，在再灌注3、6、12、24 h及2、4、7 d分別檢測(cè)移植心臟心肌細(xì)胞磷酸化蛋白激酶(p-AKT)、細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶1/2(p-ERK1/2)蛋白表達(dá)、mPTP開(kāi)放程度和心肌梗死范圍。結(jié)果在再灌注的7個(gè)時(shí)相點(diǎn)，缺血后處理組與再灌注組心肌細(xì)胞p-AKT與p-ERK1/2蛋白表達(dá)及mPTP開(kāi)放程度對(duì)應(yīng)比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.05)，兩組蛋白表達(dá)及mPTP開(kāi)放程度均明顯高于假手術(shù)組(均P<0.05)；缺血后處理組心肌梗死范圍顯著小于再灌注組(P<0.05或P<0.01)。結(jié)論缺血后處理在大鼠移植心臟心肌缺血/再灌注3 h至7 d內(nèi)能有效升高心肌細(xì)胞p-AKT、p-ERK1/2蛋白的表達(dá)，抑制心肌細(xì)胞mPTP開(kāi)放，縮小心肌梗死范圍。

關(guān)鍵詞:缺血后處理；缺血/再灌注損傷；心肌/再灌注損傷營(yíng)救激酶；線粒體通透性轉(zhuǎn)換孔

Effect of Ischemic Postconditioning on the Reperfusion Injury Salvage Kinase and Mitochondrial Permeability Transition Pore at Different Time Phases of Myocardial Ischemia-reperfusionon in RatsXIAOJun1a,LILi1b,JIANGZhen-Yu1b,SHIYing-Chang1b,SUNJia-zheng2,LIUWei-Quan2,SUNHui-Na1a,TAOYao-Bing1a.(1a.DepartmentofCardiology, 1b.CenterforAnimalExperiment,309thHospitalofChinesePLA,Beijing100091,China; 2.CollegeofBiologicalSciences,ChinaAgriculturalUniversity,Beijing100091,China)

Abstract:ObjectiveTo explore the effects of ischemic postconditioning on the reperfusion injury salvage kinase and the opening of mitochondrial permeability transition pore(mPTP) at different time phases of myocardial ischemia-reperfusion injury in rats.MethodsIsogenic adult Lewis rat models of cervical heterotopic and working-heart transplantation were established. The 120 recipients were divided into ischemia-reperfusion group，ischemic postconditioning group and sham operation group,8 rats in the sham operation group, 56 in the other two groups respectively,8 for each time phase point.Myocardial infarction size,expression of p-AKT and p-ERK1/2 protein and the opening of mPTP were measured respectively at 3, 6, 12,24-hour and 2,4, 7-day after reperfusion.ResultsThe expression of p-AKT and p-ERK1/2 protein and the opening of mPTP were statistically significant different between the ischemia-reperfusion group and ischemic postconditioning group at 7 time points after reperfusion(P<0.05),while both of which were higher than the sham operation group.The myocardial infarction range of the postconditioning group was less than the ischemia-reperfusion group(P<0.05).ConclusionIschemic postconditioning can increase the expression of p-AKT and p-ERK1/2 protein，decrease the opening of mPTP and myocardial infarction range between 3 hours and 7 days after the reperfusion after myocardial ischemia in rats.

Key words:Ischemic postconditioning; Myocardial ischemia-reperfusion injury; Reperfusion injury salvage kinase; Mitochondrial permeability transition pore

收稿日期：2014-09-01修回日期：2014-11-27編輯：伊姍

基金項(xiàng)目：北京市自然科學(xué)基金(7122178)

中圖分類(lèi)號(hào)：R541.4
doi：10.3969/j.issn.1006-2084.2015.05.046

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

文章編號(hào)：1006-2084(2015)05-0890-03