賈少坤　王　雁　隋愛華(青島大學(xué)附屬醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，山東　青島　266003)

NINJ2基因多態(tài)性與血管性認(rèn)知功能障礙的相關(guān)性

賈少坤王雁隋愛華1
(青島大學(xué)附屬醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，山東青島266003)

〔摘要〕目的探討神經(jīng)損傷誘導(dǎo)蛋白(NINJ2)基因rs11833579、rs12425791位點(diǎn)多態(tài)性與血管性認(rèn)知功能障礙(VCI)遺傳易感性的相關(guān)性。方法采用聚合酶鏈反應(yīng)-限制性片段長度多態(tài)性技術(shù)(PCR-RFLP)對112例VCI患者(VCI組)、108例腦梗死后無認(rèn)知功能障礙患者(NCI組) 及113例健康者(對照組)的NINJ2 rs11833579、rs12425791位點(diǎn)進(jìn)行基因型檢測，比較基因型和等位基因頻率在各組是否存在差異并進(jìn)行關(guān)聯(lián)性分析。結(jié)果①rs11833579位點(diǎn):三組間基因型、等位基因分布差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2= 1.942，P＞0.05;χ2= 1.343，P＞0.05) ;多元Logistic回歸校正危險(xiǎn)因素后，VCI組及NCI組AA+AG基因型對患病風(fēng)險(xiǎn)無明顯影響。②rs12425791位點(diǎn):三組基因型、等位基因分布差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2= 27.036，P＜0.05;χ2=19.816，P＜0.05) ;多元Logistic回歸校正危險(xiǎn)因素后，VCI組及NCI組AA+AG基因型與VCI、腦梗死的發(fā)病呈相關(guān)關(guān)系(OR= 1.785，95％CI 1.008～3.159，P＜0.05; OR= 1.864，95％CI 1.061～3.274，P＜0.05)。結(jié)論NINJ2 rs12425791基因多態(tài)性與VCI、腦梗死發(fā)病顯著相關(guān)。NINJ2 rs12425791可能是VCI、腦梗死的共同易感基因。

〔關(guān)鍵詞〕血管性認(rèn)知功能障礙; NINJ2基因;腦梗死;多態(tài)性;單核苷酸

1青島大學(xué)附屬醫(yī)院中心實(shí)驗(yàn)室

第一作者:賈少坤(1988-)，女，在讀碩士，主要從事腦血管病研究。

遺傳因素在血管性認(rèn)知功能障礙(VCI)的發(fā)病中發(fā)揮重要作用，APOEε4〔1〕、MTHFR〔2〕已被證實(shí)與VCI的發(fā)病有關(guān)。近年來，全基因關(guān)聯(lián)組研究(GWAS)成為篩選疾病易感基因的有效工具。2009年，一項(xiàng)全基因組關(guān)聯(lián)研究發(fā)現(xiàn)神經(jīng)損傷誘導(dǎo)蛋白NINJ2上游位點(diǎn)rs12425791、rs11833579與白種人群缺血性腦卒中有關(guān)聯(lián)〔3〕，隨后，國內(nèi)外研究發(fā)現(xiàn)，NINJ2與缺血性腦卒中、阿爾茨海默病(AD)的發(fā)病有關(guān)〔4～6〕。缺血性腦卒中是VCI發(fā)生的重要病因，腦梗死和VCI有著共同的致病因素。本文探討神經(jīng)損傷誘導(dǎo)蛋白NINJ2基因與VCI易感性的相關(guān)性。

1　資料和方法

1.1研究對象選擇2012年12月至2014年1月青島大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科腦梗死患者220例(包括無認(rèn)知功能障礙患者108例，VCI患者112例)及同期健康體檢者113例。220例腦梗死患者診斷參照中國急性缺血性腦卒中診治指南2010〔7〕，全部患者經(jīng)頭部CT或MRI證實(shí)有梗死灶并按照TOAST標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行分型〔8〕。本實(shí)驗(yàn)?zāi)X梗死患者僅納入大動(dòng)脈粥樣硬化型。所有研究對象由2名以上神經(jīng)內(nèi)科醫(yī)師應(yīng)用簡易精神狀態(tài)檢查量表(MMSE)〔9，10〕、臨床癡呆評定量表(CDR)〔11〕及Hachinski缺血指數(shù)〔12〕評估并分組。

1.2診斷及排除標(biāo)準(zhǔn)(1) VCI組112例，男58例，女54例，平均年齡(69.49±6.371)歲。VCI診斷參照2011年腦血管認(rèn)知障礙診治指南〔13〕，并參照文獻(xiàn)〔14～16〕制定標(biāo)準(zhǔn)如下: MMSE評分≤24分，CDR評分≥0.5分，Hachinski缺血指數(shù)≥7分。(2)無認(rèn)知功能障礙腦梗死組(NCI組) 108例，男53例，女55例，平均年齡(68.43±5.789)歲。全部患者經(jīng)頭部CT或MRI證實(shí)有梗死灶，MMSE評分正常。(3)體檢健康者(對照組) 113例，男61例，女52例，平均年齡(68.11±5.992)歲。其臨床及影像學(xué)檢查無腦血管病病灶及腦血管病史，MMSE評分正常。(4)排除標(biāo)準(zhǔn):所有研究對象須排除心源性腦梗死、腦靜脈竇血栓形成、動(dòng)脈炎等其他病因或不明原因腦梗死、非腦血管因素認(rèn)知功能損害(腦炎、AD、路易體癡呆)、心房顫動(dòng)、肝腎功能不全、既往精神疾病病史、癌癥等。

1.3基因組DNA的提取收取研究對象5 ml清晨空腹外周血于EDTA抗凝管，血漿離心分離后－80℃保存。采用血液基因組DNA提取試劑盒(北京天根生化科技有限公司)提取。

1.4NINJ2基因型檢測應(yīng)用限制性片段長度多態(tài)性-聚合酶鏈反應(yīng)(PCR-RFLP)進(jìn)行SNP位點(diǎn)基因型測定。所有引物均由上海生工生物工程股份有限公司合成。PCR擴(kuò)增及擴(kuò)增產(chǎn)物的酶切嚴(yán)格按照說明書操作。各位點(diǎn)引物序列、限制性內(nèi)切酶及酶切片段: rs11833579正義鏈: GTAGAGGCAGGAGGTCACTTG，反義鏈: TCCCTCTATTCAGCCAGATGTA;限制性內(nèi)切酶: FokⅠ;酶切產(chǎn)物: AA: 390 bp; GG: 291、99 bp; AG: 390、291、99 bp。rs12425791正義鏈: TCTCCTTCATACTGTTGACCTT，反義鏈: TTGTCAGAGGAGAAACCAAGTAC;限制性內(nèi)切酶: Sca I;酶切產(chǎn)物: GG: 185 bp; AA: 144、41 bp; AG: 185、144、41 bp，電泳及測序圖見圖1、圖2。

1.5統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SPSS21.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行單因素方差分析或χ2檢驗(yàn)?；蛴?jì)數(shù)法統(tǒng)計(jì)各組基因型和等位基因頻率，經(jīng)Hardy-Weinberg平衡檢驗(yàn)后，采用χ2檢驗(yàn)比較各組基因型頻率和等位基因頻率差異，采用多元Logistic回歸分析計(jì)算相對危險(xiǎn)度(OR)及95％可信區(qū)間(CI)。

2　結(jié)果

2.1各組一般資料比較兩組高血壓史、糖尿病史，低密度脂蛋白(LDL)、高密度脂蛋白(HDL)水平有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.05)。三組性別、年齡、吸煙比例及甘油三酯(TG)、總膽固醇(TC)水平均無差異(P＞0.05)。見表1。

圖1　rs11833579位點(diǎn)、PCR-RFLP結(jié)果及片段基因測序圖

圖2　rs12425791位點(diǎn)PCR-RFLP結(jié)果及片段基因測序圖

表1　各組研究對象一般資料比較(±s)

與對照組比較: 1) P＜0.05;與NCI組比較: 2) P＜0.05

VCI組(n=112) NCI組(n=108)對照組(n=113) 男/女(n)　58/54　53/55　61/52年齡(歲)　 69.49±6.371　 68.43±5.789　 68.11±5.992高血壓〔n(％)〕　100(89.2)1)　90(83.3)1)　70(62.0)糖尿病病史〔n(％)〕　28(25.0)1)　30(27.8)1)　22(19.4)吸煙〔n(％)〕　40(35.7)　 54(50.0)　 40(35.4) TG(mmol/L)　 1.72±0.522　 1.64±0.524　 1.58±0.571 TC(mmol/L)　 4.54±0.765　 4.49±0.754　 4.46±0.745 HDL(mmol/L)　 1.04±0.2111) 2)1.07±0.1951)　1.13±0.225 7 LDL(mmol/L)　 2.88±0.7201) 2)2.68±0.6461)　2.66±0.694

2.2Hardy-Weinberg平衡檢驗(yàn)各組基因型分布均符合Hardy-Weinberg平衡(P＞0.05)，表明本實(shí)驗(yàn)受試者具有群體代表性，見表2。

表2　NINJ2基因多態(tài)性的Hardy-Weinberg遺傳平衡檢驗(yàn)(n)

2.3基因型和等位基因頻率比較

2.3.1rs11833579位點(diǎn)三組間基因型和等位基因頻率無顯著差異(χ2=1.942，P＞0.05;χ2=1.343，P＞0.05)，見表3。

表3　NINJ2基因rs11833579、rs12425791位點(diǎn)基因型及等位基因頻率分布〔n(％)〕

2.3.2rs12425791位點(diǎn)三組間基因型頻率差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=27.036，P＜0.05) ;與對照組相比，VCI組及NCI組基因型頻率差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2= 18.975，P＜0.05;χ2= 6.145，P＜0.05)。VCI組與NCI組比較，基因型頻率差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=9.558，P＜0.05)。rs12425791位點(diǎn)，三組間等位基因頻率差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2= 19.816，P＜0.05) ;與對照組相比，VCI組及NCI組等位基因頻率差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2= 19.785，P＜0.05;χ2= 5.211，P＜0.05)。VCI組與NCI組比較，基因型頻率差異顯著(χ2=4.672，P＜0.05)，見表4。

2.3.3NINJ2 SNP位點(diǎn)相關(guān)性分析由于兩位點(diǎn)AA基因型在各組例數(shù)較少，故合并基因型(顯性模型)采用多元Logistic回歸分析計(jì)算校正高血壓、糖尿病、低密度脂蛋白、高密度脂蛋白危險(xiǎn)因素前、后相關(guān)性。rs11833579位點(diǎn):校正危險(xiǎn)因素前、后，VCI組及NCI組AA+AG基因型均對患病風(fēng)險(xiǎn)無明顯影響。rs12425791位點(diǎn):校正危險(xiǎn)因素前，VCI組及NCI組AA+AG基因型與VCI、腦梗死的發(fā)病有相關(guān)關(guān)系(P＜0.05)。在校正危險(xiǎn)因素后，VCI及NCI組AA+AG基因型仍與VCI、腦梗死的發(fā)病呈相關(guān)關(guān)系(P＜0.05)。見表4。

表4　NINJ2基因型校正危險(xiǎn)因素前后各組OR值(95％ CI)

3　討論

神經(jīng)損傷誘導(dǎo)蛋白NINJ2基因位于人類染色體12P13，由4個(gè)外顯子和3個(gè)內(nèi)含子組成，編碼合成神經(jīng)損傷誘導(dǎo)蛋白2 (Ninjurin2)〔17，18〕。Ninjurin 2是一種由142個(gè)氨基酸組成的細(xì)胞間親同種黏附分子，與同源蛋白Ninjurin 1合稱為神經(jīng)損傷誘導(dǎo)蛋白(Ninjurin)，Ninjurin蛋白與神經(jīng)損傷的修復(fù)有關(guān)。NINJ2基因、rs11833579、rs12425791位于NINJ2基因5，端非編碼區(qū)，通過NINJ2啟動(dòng)子參與Ninjurin 2的表達(dá)調(diào)控〔3〕。

目前，NINJ的基因研究熱點(diǎn)為rs11833579、rs12425791兩個(gè)位點(diǎn)。Ikram等〔3〕在全基因組關(guān)聯(lián)研究(GWAS)中發(fā)現(xiàn)NINJ2上游位點(diǎn)rs11833579、rs12425791與白種人群缺血性腦卒中有關(guān)聯(lián)，特別是動(dòng)脈粥樣硬化導(dǎo)致的缺血性腦卒中。隨后，Matsushita等〔4〕在日本人群發(fā)現(xiàn)rs12425791位點(diǎn)與動(dòng)脈粥樣硬化型腦梗死強(qiáng)相關(guān)，但在歐洲血統(tǒng)人群中沒有證實(shí)rs12425791、rs11833579與卒中發(fā)病相關(guān)〔19〕。王欣等〔5〕在中國漢族腦卒中的研究中發(fā)現(xiàn)rs12425791與中國漢族卒中發(fā)病呈相關(guān)關(guān)系，但未能發(fā)現(xiàn)rs11833579與該人群發(fā)病有顯著關(guān)系。此外，Lin等〔6〕在AD、血管性癡呆(VD)和健康者對照研究中研究發(fā)現(xiàn)rs12425791、rs11833579多態(tài)性與AD發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)顯著性相關(guān)。

Gabrille等〔20〕提出，理想的VCI易感基因可分為2種:①與腦血管疾病有關(guān)的基因。②影響腦組織對腦血管病變發(fā)生反應(yīng)(如腦血管損傷修復(fù))的基因。為確定NINJ2基因?qū)儆谀囊活愐赘谢?，我們設(shè)立了NCI組與VCI組對比。

本研究提示NINJ2 rs12425791位點(diǎn)可能是VCI、無認(rèn)知功能障礙腦梗死的共同遺傳風(fēng)險(xiǎn)標(biāo)記。遺傳因素對大動(dòng)脈粥樣硬化型腦梗死的影響更明顯〔21〕，推測遺傳因素對大動(dòng)脈粥樣硬化型腦梗死患者組的影響程度高于Lin等〔6〕選取的小血管型腦梗死后VD患者，這種遺傳背景差異可能是導(dǎo)致研究結(jié)果不一致的原因，還有待擴(kuò)大樣本后進(jìn)一步論證。本文提示NINJ2 rs12425791位點(diǎn)可能與腦血管損傷修復(fù)有關(guān)。

NINJ2編碼的神經(jīng)損傷誘導(dǎo)蛋白Ninjurin2在中樞神經(jīng)放射膠質(zhì)細(xì)胞中低表達(dá)〔17，18〕。神經(jīng)損傷后，NINJ2在神經(jīng)遠(yuǎn)端的Schwann細(xì)胞中表達(dá)上調(diào)，受損神經(jīng)軸突在神經(jīng)損傷誘導(dǎo)蛋白親同種抗原的黏附作用下順Schwann細(xì)胞帶生長延伸，同時(shí)，NINJ2基因所編碼的神經(jīng)損傷誘導(dǎo)蛋白可以與神經(jīng)細(xì)胞黏附分子(N-CAM)、細(xì)胞黏附分子(L1)等分子相互作用，參與炎癥反應(yīng)〔17，18〕。NINJ2通過神經(jīng)修復(fù)直接影響腦對血管疾病的反應(yīng)外，此外，Ninjurin還可對腦缺血性損傷耐受性造成影響〔22〕，但其作用機(jī)制尚不清楚，仍需進(jìn)一步研究。

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〔2015-01-17修回〕

(編輯曹夢園)

通訊作者:王雁(1968-)，女，博士，主任醫(yī)師，碩士生導(dǎo)師，主要從事腦血管病研究。

基金項(xiàng)目:山東省自然科學(xué)基金(ZR2010HM021)

〔中圖分類號〕R749.1

〔文獻(xiàn)標(biāo)識碼〕A

〔文章編號〕1005-9202(2015) 16-4533-04;

doi:10.3969/j.issn.1005-9202.2015.16.049