晉佳路　朱仁書　謝育媛　劉紅春(鶴壁職業(yè)技術(shù)學院醫(yī)學院，河南　鶴壁　458030)

CDK2 shRNA慢病毒載體的構(gòu)建及其基因沉默效應(yīng)

晉佳路朱仁書謝育媛1劉紅春2
(鶴壁職業(yè)技術(shù)學院醫(yī)學院，河南鶴壁458030)

〔摘要〕目的構(gòu)建CDK2 shRNA慢病毒載體，并在黑色素瘤細胞B16-F1中鑒定其基因沉默效應(yīng)。方法體外構(gòu)建3個慢病毒重組目的質(zhì)粒pUL-CDK2-shRNAs和1個陰性對照慢病毒重組質(zhì)粒pUL-NC-shRNA，轉(zhuǎn)化感受態(tài)細胞，PCR鑒定后進一步測序驗證; 293T細胞中測定病毒滴度;用重組慢病毒感染B16-F1細胞測定其感染效率，RT-PCR和Western印跡檢測其對B16-F1細胞中CDK2的基因沉默效應(yīng)。結(jié)果PCR鑒定后進一步測序表明，成功構(gòu)建了重組慢病毒質(zhì)粒;病毒滴度為4.5×107～5.5×107TU/ml;用重組慢病毒感染B16-F1細胞，當感染復數(shù)(MOI)為10時，感染效率可達90％; RT-PCR和Western印跡結(jié)果表明，與未感染組和NC-shRNA感染組細胞相比，CDK2-shRNA1、CDK2-shRNA2、CDK2-shRNA3感染的細胞中CDK2 mRNA和蛋白表達均受到不同程度抑制(P＜0.05)，以CDK2-shRNA3感染組的抑制率最高，RT-PCR和Western Blot檢測其抑制率分別為78.5％±4.23％和70.5％±3.54％。結(jié)論利用RNAi技術(shù)成功構(gòu)建了3種CDK2-shRNA重組慢病毒載體，均可有效感染B16-F1細胞并具有一定的基因沉默效應(yīng)，其中以針對靶位點1012-1020的pUL-CDK2-shRNA3基因沉默效應(yīng)最強，為進一步研究CDK2基因沉默對黑色素瘤化療敏感性的影響奠定了基礎(chǔ)。

〔關(guān)鍵詞〕CDK2;慢病毒載體; shRNA;基因沉默

1湖北省食品藥品監(jiān)督檢驗研究院2鄭州大學第一附屬醫(yī)院

第一作者:晉佳路(1972-)，女，副教授，博士，主要從事腫瘤的生物治療與基因治療研究。

周期素依賴性蛋白激酶(CDKs)對細胞分裂周期起關(guān)鍵作用，其中CDK2是CDK家族的重要成員，它通過與cyclin A、cyclin E結(jié)合形成復合物參與細胞周期，不僅控制S期DNA合成的起始，而且控制G1期進入S期〔1～3〕。研究發(fā)現(xiàn)多種腫瘤細胞高表達CDK2，黑色素瘤中CDK2的表達尤其活躍〔4，5〕。因此，下調(diào)CDK2基因表達水平有可能阻止或延緩細胞分裂增殖，從而達到抗腫瘤的目的，但目前針對小鼠的CDK2基因沉默研究文獻鮮見報道。本研究擬構(gòu)建CDK2 shRNA重組慢病毒載體，使用高表達CDK2的小鼠黑色素瘤細胞B16-F1檢測CDK2 shRNA對基因的沉默效應(yīng)，為后期研究黑色素瘤的基因治療及其對黑色素瘤化療敏感性的影響奠定基礎(chǔ)。

1　材料和方法

1.1主要材料慢病毒質(zhì)粒pRNAT-U6.2/Lenti(pUL，Gen-Script公司) ;包裝質(zhì)粒pLP1、pLP2和pLP/VSVG，Polybrene，LipofectineTM2000(Invitrogen公司) ;感受態(tài)大腸桿菌DH5α，293T細胞，B16-F1細胞(中國典型培養(yǎng)物保藏中心) ;限制性內(nèi)切酶BamHⅠ和XhoⅠ，T4 DNA連接酶和質(zhì)粒DNA小提試劑盒(TaKaRa公司) ; DMEM培養(yǎng)液、胰蛋白酶(Hycolone公司) ;胎牛血清(杭州四季青公司) ; Taq DNA聚合酶(Fementas公司) ;瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒(Promega公司) ; Trizol、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、SYBR Green熒光定量PCR試劑盒(TaKaRa公司) ; PVDF膜和ECL試劑(Invitrogen)，β-actin抗體、CDK2抗體(Santa Cruz公司) ;其他試劑均為國產(chǎn)或進口分析純。

1.2CDK2 shRNA慢病毒重組質(zhì)粒構(gòu)建及鑒定

1.2.1shRNA oligo DNA序列的設(shè)計與合成根據(jù)GenBank小鼠cdk2基因信息(NM_016756.4)，應(yīng)用干擾序列設(shè)計軟件，經(jīng)NCBI BLAST同源性分析，選擇3條含有19個核苷酸的特異性序列作為RNAi的靶序列: 382～400位(CTCTCCTTAAGGAACTTA)、482～500位(CCTCAAGAAATTCATGGA)、1 012～1 020位(CGGAGCTTGTTATCGCAAA)。同時選擇1條無意義序列作為陰性對照: 5’TTCTCCGAACGTGTCACG3’。然后按照siRNA設(shè)計原則，設(shè)計并合成3對特異性shRNA oligo DNA(分別命名為CDK2-shRNA1，2，3)和1對陰性對照shRNA oligo DNA(命名為NC shRNA，即negative control shRNA)，并在其5＇-端和-3＇端分別引入BamH I和Xho I酶切位點。每對shRNA oligo DNA中正義鏈序列為5＇-BamH I (G/GATCC) +靶序列+loop (TTCAAGAGA) + (靶序列的反向互補序列) +終止信號(TTTTT) +Xho I(C/TCGAG) -3＇，由上海生工公司合成。

1.2.2慢病毒重組質(zhì)粒的構(gòu)建及鑒定將合成的正義和反義shRNA oligo DNA經(jīng)退火形成4對含有黏性末端雙鏈DNA片段。用BamHⅠ和XhoⅠ雙酶切慢病毒質(zhì)粒pRNAT-U6.2/Lenti(簡稱為pUL)，純化回收線性化片段，再用T4 DNA連接酶與雙鏈DNA連接。連接產(chǎn)物(命名為pUL-CDK2-shRNAs)轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細胞，挑選重組陽性克隆擴增，提取質(zhì)粒，經(jīng)PCR鑒定正確后進一步測序驗證。PCR引物在載體多克隆位點兩側(cè)設(shè)計，正義: 5＇-GGACTATCATATGCTTACCG-3＇;反義: 5＇-ACCGAGGAGAGGGTTAGGGAT-3＇。

1.3慢病毒重組質(zhì)粒的包裝及病毒滴度測定將4種慢病毒重組質(zhì)粒分別與包裝質(zhì)?；旌衔?pLP1、pLP2和pLP /VSVG) 按LipofectamineTM2000說明書共轉(zhuǎn)染293T細胞。轉(zhuǎn)染6 h后更換為新鮮培養(yǎng)基，培養(yǎng)48 h后，收集病毒上清，獲得濃縮的病毒顆粒，按1ml/支分裝，置－80℃長期保存。將濃縮的病毒顆粒10倍倍比稀釋(1～10－7)后，分別感染293T細胞，培養(yǎng)24 h后，更換完全培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)48 h，熒光顯微鏡下觀察細胞熒光表達情況并計算病毒滴度。

1.4重組慢病毒感染B16-F1細胞用重組慢病毒顆粒分別感染B16-F1細胞，感染前1 d將B16細胞接種于6孔板中，每孔接種105個細胞，于37℃、5％ CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)，24 h后開始病毒感染，感染復數(shù)(MOI)為10，感染12 h后更換新鮮培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)60 h。在熒光顯微鏡下觀察綠色熒光蛋白GFP的表達，以判斷慢病毒感染效率。

1.5RT-PCR檢測CDK2 mRNA的表達收集重組慢病毒感染72 h后的各組B16-F1細胞及空白對照組(CON組)細胞，按照TrIzol試劑說明書提取細胞總RNA，瓊脂糖凝膠電泳檢測總RNA質(zhì)量，紫外分光光度法測定其濃度。取5 μg總RNA，使用反轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA，使用SYBR Green熒光定量PCR試劑進行RT-PCR檢測。實驗重復5次，每次每個樣本做3個復孔。

1.6Western印跡檢測CDK2蛋白的表達收集重組慢病毒感染后的各組B16-F1細胞及CON組細胞，提取細胞總蛋白，BCA法進行蛋白定量。各組取等量蛋白上樣，SDS-PAGE凝膠電泳，電泳后將目的條帶轉(zhuǎn)移到PVDF膜上，在室溫下用含5％脫脂奶粉的TBST封閉1 h，與一抗室溫孵育2 h，洗去未結(jié)合的一抗，加二抗，再與二抗在室溫下孵育1 h，最后用ECL使目的條帶在X膠片上曝光。

1.7統(tǒng)計學分析采用SPSS14.0軟件，計量資料組間均數(shù)比較采用單因素方差分析和LSD-t檢驗。

2　結(jié)果

2.1CDK2-shRNA慢病毒重組質(zhì)粒的構(gòu)建及鑒定CDK2-shRNAs重組陽性克隆的PCR產(chǎn)物約為276 bp;空載體克隆的PCR產(chǎn)物約為229 bp，與預期結(jié)果相符(圖1)。進一步測序證明，CDK2-shRNA1、CDK2-shRNA2、CDK2-shRNA3、NC-shRNA序列插入正確(圖2)。

圖1　PCR對CDK2-shRNAs重組質(zhì)粒的鑒定結(jié)果

圖2　　慢病毒重組質(zhì)粒插入序列測序結(jié)果(展示CDK2-shRNA3插入序列)

2.2慢病毒重組質(zhì)粒的包裝及病毒滴度測定結(jié)果表明，每種重組慢病毒滴度均達4.5×107～5.5×107TU/ml，符合后續(xù)試驗要求。

2.3B16-F1細胞感染效率鑒定通過普通明光視野和綠色熒光視野對比可見，MOI為10時，約90％的細胞均可見綠色熒光(圖3)。

2.4基因沉默效率檢測

2.4.1RT-PCR檢測各組抑制效率未感染病毒組(CON組，0.175±0.013)與NC-shRNA感染組(NC組，0.173±0.016)之間無統(tǒng)計學差異(P＞0.05)，3個陽性感染組(CDK2-shRNA1、2、3感染組分別為0.073±0.014、0.133±0.029、0.029±0.014)與前兩組相比有統(tǒng)計學差異(P＜0.05)，均表現(xiàn)出不同程度的抑制，其抑制率分別為52.8％±6.35％、30.7％±7.54％、78.5％± 4.23％，其中以CDK2-shRNA3感染組的抑制率最高。

2.4.2Western印跡檢測各組抑制效率CON組與NC組之間差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)，CDK2-shRNA1、2、3感染組與前兩組相比差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)，均表現(xiàn)出不同程度的抑制，其抑制率分別為50.4％±7.21％、35.3％±4.33％、70.5％±3.54％，其中以CDK2-shRNA3感染組的抑制率最高(圖4)。

圖3　重組慢病毒感染B16-F1細胞72 h的感染效果(MOI=10) (×100)

圖4　Western印跡檢測CDK2蛋白的表達

3　討論

RNA干擾(RNAi)是指由短雙鏈RNA誘導的同源RNA特異性降解的過程，可使基因的表達受到抑制。發(fā)揮RNAi作用的短雙鏈RNA被稱作小干擾RNA(siRNA)〔6，7〕。短發(fā)夾狀RNA(shRNA)是采用病毒載體或質(zhì)粒表達的siRNA，即具有RNA聚合酶Ⅲ啟動子U6或H1及其下游一小段特殊結(jié)構(gòu)的重組病毒載體或重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染到宿主細胞后，轉(zhuǎn)錄出shRNA，shRNA在細胞內(nèi)被Dicer復合酶剪切成siRNA而發(fā)揮作用〔8〕。目前，實現(xiàn)RNAi常用的載體有病毒載體或質(zhì)粒載體，其中慢病毒載體越來越多地被選用作為運載外源基因的工具，因為慢病毒載體具有既可感染非分裂期細胞又可感染分裂期細胞、感染效率高、容納外源性基因片段大、可長期表達且未見病理損害現(xiàn)象等顯著優(yōu)點。另外，在慢病毒載體中，可以整合標簽序列如His、GFP等，通過檢測標簽可直觀地觀察感染效率，為基因功能的研究提供更強大的工具〔9，10〕。pRNAT-U6.2/Lenti(pUL)是專門在真核細胞內(nèi)轉(zhuǎn)錄生成shRNA的表達載體。

本實驗成功構(gòu)建了針對CDK2基因的shRNA慢病毒重組載體。將CDK2-shRNA慢病毒重組載體轉(zhuǎn)染293T細胞，包裝產(chǎn)生了滴度高達4.5×107～5.5×107TU/ml的病毒顆粒，完全能夠滿足后續(xù)實驗。用重組病毒顆粒感染小鼠黑色素瘤細胞B16-F1，感染效率可達90％，說明獲得了高感染效率的慢病毒顆粒。RTPCR和Western blot檢測基因沉默效應(yīng)，結(jié)果表明靶基因干擾序列均能對CDK2的表達起到顯著抑制作用，說明構(gòu)建的針對CDK2基因的shRNA慢病毒重組載體進入細胞后表達了shRNA，shRNA在胞內(nèi)Dicer酶的作用下將單鏈環(huán)狀結(jié)構(gòu)切除降解，剩下19～23 bp的短雙鏈DNA即為siRNA，進入RNAi通道，形成RNAi沉默復合物，對CDK2 mRNA進行降解。構(gòu)建的三個shRNA重組慢病毒以針對1012-1020位靶序列的基因沉默效應(yīng)最為顯著，本研究為進一步研究黑色素瘤的基因治療及基因沉默對黑色素瘤化療藥物敏感性研究提供了理想的工具。

4　參考文獻

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〔2015-06-10修回〕

(編輯曲莉)

通訊作者:劉紅春(1963-)，女，博士，教授，主任技師，主要從事腫瘤基因診斷研究。

基金項目:河南省科技計劃項目(122300410193) ;河南省高等學校青年骨干教師資助計劃項目(2011GGJS-262)

〔中圖分類號〕R73-3

〔文獻標識碼〕A

〔文章編號〕1005-9202(2015) 16-4483-03;

doi:10.3969/j.issn.1005-9202.2015.16.028