林哲洙　張　紅　張　磊　羅文棟(遼寧醫(yī)學(xué)院附屬第三醫(yī)院腫瘤外科，遼寧　錦州　121000)

Beclin1基因在胃癌發(fā)生和演進(jìn)中的分子作用機(jī)制

林哲洙張紅張磊羅文棟
(遼寧醫(yī)學(xué)院附屬第三醫(yī)院腫瘤外科，遼寧錦州121000)

〔摘要〕目的探討胃癌發(fā)生和演進(jìn)中Beclin1基因的表達(dá)水平及其與臨床特征的關(guān)系。方法胃癌、癌旁黏膜和轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)石蠟或新鮮標(biāo)本各30例進(jìn)行免疫組織化學(xué)檢測。結(jié)果Beclin1蛋白在胃癌組織中的表達(dá)定位于細(xì)胞質(zhì)，在胃癌組、胃癌前病變和對照組中的表達(dá)強(qiáng)度逐漸增強(qiáng)，在對照組中絕大多數(shù)為強(qiáng)陽性表達(dá)。三組灰度值差異顯著(P＜0.05) ;組間兩兩比較，差異均顯著(P＜0.05)。Beclin1的表達(dá)強(qiáng)度與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及胃癌分化程度密切相關(guān)(P＜0.05)，與腫瘤的部位、大小、浸潤深度和TNM分期無明顯相關(guān)性(P＞0.05)。結(jié)論Beclin1蛋白表達(dá)改變對胃癌的分化及轉(zhuǎn)移影響較大。早期檢測Beclin1蛋白的表達(dá)水平對胃癌的早期診斷及預(yù)后評估意義重大。

〔關(guān)鍵詞〕Beclin1基因;胃癌

第一作者:林哲洙(1973-)，男，博士，主治醫(yī)師，主要從事腫瘤學(xué)及普通外科學(xué)研究。

雖然化療、放療、基因治療和生物治療在胃癌治療中廣泛應(yīng)用，但胃癌侵襲和轉(zhuǎn)移仍是其生存率無法大幅提升的主要原因。近年來研究發(fā)現(xiàn)Beclin1過表達(dá)抑制裸鼠體內(nèi)腫瘤形成〔1〕。Beclin1蛋白表達(dá)下調(diào)可見于肝癌和卵巢癌。目前關(guān)于Beclin1基因表達(dá)在胃癌發(fā)生、侵襲和轉(zhuǎn)移中的作用及對胃癌細(xì)胞表型和生物學(xué)行為作用的機(jī)制尚無直接實(shí)驗(yàn)依據(jù)。本研究擬分析胃癌組織中Beclin1蛋白表達(dá)與胃癌病理生物學(xué)特征和預(yù)后的關(guān)系。

1　材料與方法

1.1材料我院2013年1月至2014年10月胃癌、癌旁黏膜和轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)石蠟或新鮮標(biāo)本，均經(jīng)手術(shù)及病理組織學(xué)檢查證實(shí)，所有胃癌標(biāo)本術(shù)前均未接受放化療治療。將其分為3組:①胃癌組30例，男14例，女16例，年齡32～74歲，平均(57.0± 7.1)歲。其中未侵及漿膜層者10例，侵及漿膜層者20例;局部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者12例，無局部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者18例;高、中分化腺癌11例，低、未分化腺癌19例;腫瘤臨床病理分期采用2010年國際抗癌聯(lián)盟/美國癌癥聯(lián)合委員會(UICC/AJCC)的TNM分期標(biāo)準(zhǔn)，其中Ⅰ+Ⅱ期14例，Ⅲ+Ⅳ期16例。②胃癌前病變組(中、重度不典型增生) 30例:男17例，女13例，年齡31～70歲，平均(54.5±7.2)歲;③對照組(慢性非萎縮性胃炎) 30例，男15例，女15例，年齡22～76歲，平均(52.4±7.6)歲。標(biāo)本均給予10％甲醛溶液固定，石蠟包埋后連續(xù)切片，大小為3 μm。臨床及病理資料均無缺失。

1.2試劑兔抗人Beclin1多克隆抗體(即用型)購自美國Proteintech Group; SP免疫組化試劑盒(PV-6001)和DAB增強(qiáng)性顯色試劑盒(ZL19044)購自北京中杉生物試劑公司。

1.3儀器ABI PTISM 7500實(shí)時PCR和VeritiTMPCR擴(kuò)增儀; BX41 Olympus顯微鏡; Sigma、thermo和Tomy超低溫高速離心機(jī); UVP自動成像系統(tǒng)、Leica組織自動包埋機(jī)、Sandon石蠟切片機(jī)和冰凍切片機(jī);美國BD公司Facsaria 2流式細(xì)胞儀。

1.4方法將所有標(biāo)本切片，給予常規(guī)脫蠟、水化，采用SP免疫組化染色、DAB顯色，蘇木素-尹紅復(fù)染，晾干，采用中性樹膠進(jìn)行封片，具體操作參考說明書進(jìn)行，其中陰性對照標(biāo)本采用PBS替代一抗，其余操作一致。

1.5結(jié)果判斷標(biāo)準(zhǔn)使用美國康塔DMR+Q550病理圖像分析儀。以細(xì)胞質(zhì)內(nèi)出現(xiàn)淡黃色至棕褐色顆粒，且染色強(qiáng)度高于背景色者判定為陽性細(xì)胞。每個視野中的陽性表達(dá)區(qū)域取5個(400倍)，對灰度值(陽性染色的強(qiáng)度)進(jìn)行半定量測定，選5個圖像取其平均灰度值作為最終值?；叶戎蹬c陽性細(xì)胞的表達(dá)強(qiáng)度存在一定的關(guān)系，灰度值越高，說明其陽性表達(dá)量越低，反之則越高。

1.6統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SPSS18.0軟件進(jìn)行方差分析和t檢驗(yàn)。

2　結(jié)果

2.1Beclin1蛋白表達(dá)與胃癌臨床病理特征關(guān)系的分析Beclin1的表達(dá)強(qiáng)度與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及胃癌的分化程度密切相關(guān)(P＜0.05)，與腫瘤的部位、大小、浸潤深度和TNM分期無明顯相關(guān)性(P＞0.05)。見表1。

表1　Beclin1蛋白表達(dá)與胃癌臨床病理特征關(guān)系的分析(±s)

表1　Beclin1蛋白表達(dá)與胃癌臨床病理特征關(guān)系的分析(±s)

臨床病理特征　n　 Beclin1　 F值　P值腫瘤部位　　胃底、賁門　7　 138.3±10.5　 2.012＞0.05胃體　9　 137.4±11.6胃竇　14　 137.2±10.2腫瘤大小　　＞5 cm　 17　 140.2±12.9　 2.017＞0.05 ≤5 cm　 13　 139.7±11.8 TNM分期　?、?Ⅱ級　12　 141.2±10.9　 2.341＞0.05 Ⅲ+Ⅳ級　18　 142.1±10.2浸潤深度　　達(dá)漿膜層以外　10　 142.0±9.04　 2.336＞0.05未達(dá)漿膜層以外　20　 141.4±9.88淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移　　有　14　 146.8±12.4　 14.412＜0.05 無16　 137.4±12.9分化程度　　低、未分化　18　 144.7±12.4　 12.410＜0.05高、中分化　12　 136.5±11.2

2.2Beclin1蛋白在各組中的表達(dá)情況Beclin1蛋白在胃癌組織中的表達(dá)定位于細(xì)胞質(zhì)，在胃癌組、胃癌前病變和對照組中的表達(dá)強(qiáng)度逐漸增強(qiáng)，在對照組中絕大多數(shù)為強(qiáng)陽性表達(dá)。見圖1。胃癌組、胃癌前病變組、對照組灰度值(142.2±10.9、133.0±11.2、128.4±10.1)差異顯著(F= 9.023，P＜0.05) ;組間兩兩差異均顯著(P＜0.05)。

圖1　各組Beclin1蛋白免疫組化結(jié)果(HE染色，×400)

3　討論

近年來研究證明，胃癌發(fā)生和發(fā)展是多階段、多基因和多因素參與的復(fù)雜過程。其中導(dǎo)致抑癌基因功能降低或缺失在腫瘤發(fā)生和演進(jìn)中發(fā)揮重要作用。自噬是在營養(yǎng)缺乏、低氧、感染、細(xì)胞因子、激素和DNA損傷等因素作用下粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)無核糖體附著區(qū)脫落的LC3分離膜包裹細(xì)胞質(zhì)和待降解細(xì)胞器、蛋白質(zhì)等成分形成自噬體，并與溶酶體融合形成自噬溶酶體，降解其所包裹的內(nèi)容物。主要包括內(nèi)質(zhì)網(wǎng)來源的大自噬、溶酶體膜來源的小自噬及分子伴侶介導(dǎo)自噬。第一次發(fā)現(xiàn)參與自噬蛋白Beclin1與酵母菌Atg6同源，其編碼抑癌蛋白定位于高爾基體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和線粒體，引導(dǎo)相關(guān)蛋白定位于自噬體膜并參與自噬體形成〔1，2〕。

人Beclin1定位于人染色體17q21上BRCA1的150 kb著絲粒區(qū)域，其28 kD編碼蛋白含有BH3、卷曲螺旋結(jié)構(gòu)域(CCD)和進(jìn)化保守結(jié)構(gòu)域(ECD)。參與形成Beclin1復(fù)合體的主要蛋白為:①Vps34:作為一種PI3KⅢ與Beclin1 ECD和CCD結(jié)構(gòu)域結(jié)合形成的Vps34-Beclin1復(fù)合體可使磷脂酰肌醇磷酸化并產(chǎn)生三磷酸磷脂酰肌醇(PI3P)，PI3P對復(fù)合物形成具有負(fù)向調(diào)控作用。②UVRAG:可直接與Beclin1的CCD結(jié)構(gòu)域結(jié)合形成復(fù)合體，調(diào)節(jié)Beclin1與Vps34復(fù)合體形成。③Ambra1:對依賴Beclin1的自噬有正面調(diào)節(jié)作用。④抗凋亡蛋白(Bcl-2、Bcl-xL和Bcl-w) :通過BH3結(jié)構(gòu)域(疏水溝)與Beclin1兩性α螺旋(氨基酸殘基112-123)的相互作用〔3〕。死亡相關(guān)蛋白激酶(DAPK)可使Beclin1 BH3結(jié)構(gòu)域T119磷酸化阻礙Beclin1與Bcl-2/Bcl-X(L)結(jié)合，促進(jìn)自噬。細(xì)胞質(zhì)中激活c-Jun N末端激酶JNK1磷酸化Bcl-2，導(dǎo)致其與Beclin1結(jié)合能力減弱，引起自噬發(fā)生〔4～6〕。此外，TRAF6可使Lys(63) (K63)連接的Beclin1泛素化，進(jìn)而擾亂Beclin1復(fù)合物形成。Lys(63) (K63)連接的Beclin1泛素化〔7，8〕。Caspase-8和Caspase-3介導(dǎo)Beclin1斷裂可以降低自噬并促進(jìn)細(xì)胞凋亡。細(xì)胞應(yīng)激通過死亡受體激活Caspase-8，后者斷裂Beclin1 C末端對自噬具有抑制作用〔9，10〕。在轉(zhuǎn)錄水平上，轉(zhuǎn)錄因子E2F和NF-κB結(jié)合到Beclin1啟動子，促進(jìn)其表達(dá)上調(diào);而miR30a的作用相反〔4〕。

Beclin1等位缺失可胚胎致死，其雜合性可提高自發(fā)腫瘤發(fā)生率，如淋巴瘤、肝癌和肺癌，正常乳腺上皮細(xì)胞和生發(fā)中心B淋巴細(xì)胞出現(xiàn)異常增生，Beclin1缺失細(xì)胞自噬水平減少和增殖水平升高，提示Beclin1在抑制腫瘤發(fā)生方面有重要作用〔11〕。Beclin1蛋白表達(dá)下調(diào)可見于宮頸癌、肝癌和卵巢癌〔12〕，Beclin1 mRNA表達(dá)下調(diào)也可見于膠質(zhì)母細(xì)胞瘤、病期高的腦腫瘤和肺癌〔13〕。相反，Beclin1表達(dá)上調(diào)也見于皮膚鱗癌、胰腺導(dǎo)管腺癌〔14〕。Beclin1 mRNA表達(dá)上調(diào)見于肝內(nèi)膽管細(xì)胞癌和肝細(xì)胞癌〔15〕。胃癌中Beclin1蛋白高表達(dá)〔16〕。本研究結(jié)果顯示，Beclin1在胃癌組、胃癌前病變和對照組中的表達(dá)強(qiáng)度逐漸增強(qiáng)。推測其機(jī)制可能為:①腫瘤細(xì)胞在外界因子的刺激下可促進(jìn)線粒體釋放凋亡因子，此時細(xì)胞啟動促進(jìn)自噬來清除受損線粒體，導(dǎo)致線粒體的凋亡信號級聯(lián)傳導(dǎo)中斷，細(xì)胞對低氧的耐受力得到提升，在一定程度上發(fā)揮了保護(hù)細(xì)胞的作用;②Beclin1通過Bcl-2家族可發(fā)揮拮抗凋亡的作用，存進(jìn)癌細(xì)胞的高速增殖。由于Beclin1在胃癌前病變階段即表現(xiàn)出明顯的減弱，可見Beclin1表達(dá)下調(diào)可能參與胃癌的發(fā)生發(fā)展過程，對胃癌前病變患者行早期監(jiān)測Beclin1蛋白水平，有助于提高胃癌的早期診斷率。

Dong等〔15〕研究法發(fā)現(xiàn)Beclin1表達(dá)與肝內(nèi)膽管細(xì)胞癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和不良預(yù)后呈負(fù)相關(guān)，Beclin1表達(dá)與肺鱗癌和腺癌的腫塊大小呈負(fù)相關(guān)〔17〕，Beclin1表達(dá)下調(diào)與宮頸癌和卵巢癌盆腔淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和組織分級呈現(xiàn)負(fù)相關(guān)。Beclin1表達(dá)與胰導(dǎo)管腺癌的淋巴侵襲、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移和不良預(yù)后呈負(fù)相關(guān)。Chen等〔18〕報道了Beclin1表達(dá)與食道鱗癌侵襲深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和臨床分期負(fù)相關(guān)。Pirtoli等〔19〕發(fā)現(xiàn)Beclin1蛋白表達(dá)與高級膠質(zhì)瘤凋亡呈正相關(guān)，而與增殖和不良預(yù)后呈負(fù)相關(guān)。本研究提示Beclin1可能參與了胃癌細(xì)胞的分化，在胃癌的發(fā)展過程中發(fā)揮作用，與胃癌的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移關(guān)系緊密，提示Beclinl可作為評估患者預(yù)后的生物學(xué)指標(biāo)并預(yù)測胃癌的發(fā)生發(fā)展。

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〔2014-11-15修回〕

(編輯苑云杰)

基金項(xiàng)目:遼寧省科技廳項(xiàng)目(No．2013225305)

〔中圖分類號〕R735.2

〔文獻(xiàn)標(biāo)識碼〕A

〔文章編號〕1005-9202(2015) 16-4477-03;

doi:10.3969/j.issn.1005-9202.2015.16.025