凌萌智　黃治國　劉揚河(海南省干部療養(yǎng)院內(nèi)科，海南　?？凇?700)

mircoRNA-21在胃癌患者血漿中的表達及其與外周血Th1與Th2細胞關系

凌萌智黃治國1劉揚河
(海南省干部療養(yǎng)院內(nèi)科，海南?？?71100)

〔摘要〕目的探討microRNA(miRNA) -21在胃癌患者胃癌組織及血漿中的抑癌癥機制及與外周血Th1/Th2細胞的關系。方法選取該院胃癌患者(40例)為研究組，同期來我院體檢的健康人群(40例)為對照組，采用實時熒光定量PCR(RT-PCR)法檢測胃癌組織和對應癌旁組織以及兩組血漿中miRNA-21的表達水平。采用流式細胞術檢測患者外周血中Th1、Th2細胞亞群的水平，探討其與miRNA-21表達的關系。結果miRNA-21在胃癌組織中的表達水平顯著高于對應的癌旁組織(均P＜0.05) ;研究組miRNA-21的表達水平亦顯著高于對照組(P＜0.05)。Spearman相關分析顯示，胃癌組織及血漿中miRNA-21表達與胃癌的TNM分期呈顯著正相關(均P＜0.05) ;而胃癌癌旁組織中miRNA-21表達水平與TNM分期無顯著相關性(P＞0.05)。Pearson相關分析結果顯示，胃癌患者血漿中miRNA-21表達與外周血中Th1細胞呈顯著負相關，而與外周血中Th2細胞顯著正相關(均P＜0.05)。結論miRNA-21在胃癌組織中及血清中的表達明顯高于對應癌旁組織，miRNA-21具有顯著的促癌功能，其促癌的機制可能與影響體內(nèi)Th1/Th2失衡有關。

〔關鍵詞〕microRNA-21;胃癌; Th1; Th2

1?？谑腥嗣襻t(yī)院消化內(nèi)科

第一作者:凌萌智(1979-)，男，主治醫(yī)師，主要從事消化內(nèi)科方面的研究。

目前，胃癌的發(fā)病機制尚未完全明了。MicroRNA(miRNA)在腫瘤致病過程中發(fā)揮著重要的調節(jié)功能，在腫瘤組織中異常表達，且與腫瘤的分化有著密切關系〔1〕。有研究已經(jīng)發(fā)現(xiàn)miRNA-21在甲狀腺乳頭狀癌、肝癌等惡性腫瘤中表達異常，且與腫瘤分級呈正相關〔2～4〕。miRNA-21在胃癌組織以及血漿中的含量以及其對胃癌的可能影響機制的研究較少。本研究擬探討miRNA-21促進胃癌的機制。

1　資料與方法

1.1臨床資料選擇2012年11月至2014年6月來本院行胃癌手術的40例腫瘤組織標本，同時取癌旁組織;其中男21例，女19例，年齡54～74〔平均(64.13±6.21)〕歲，術前未做過任何放療及化療。對照組為同期健康體檢人群40例，其中男23例，女17例，年齡61～75〔平均(65.33±9.62)〕歲。

1.2主要試劑組織及血漿中的RNA采用上海英駿公司Trizol試劑盒提取; cDNA逆轉錄試劑盒購于美國Femantes公司; PCR試劑盒以及DEPC水均購于南京生興生化科技有限公司。miRNA-21 mimic及U6內(nèi)參的引物均由廣州銳博生物科技有限公司設計并提供。

1.3組織以及血漿標本總RNA提取及逆轉錄反應40例研究者于手術中取胃癌及對應癌旁組織。此外，清晨空腹時抽取各實驗對象外周靜脈血5 ml，加入乙二胺四乙酸(EDTA)抗凝劑(南京生興)，2 h內(nèi)于4℃，4 000 r/min離心5 min，離心后提取上層血漿備用。取約80 mg組織或200 μl血漿，加入1 ml Trizol充分勻漿后，按照說明書的要求抽提總RNA，所得RNA溶于20 μl焦碳酸二乙酯(DEPC)處理水。提取的總RNA經(jīng)紫外分光光度計進行定量。進一步采用Femantes逆轉錄試劑盒對所得RNA逆轉錄成cDNA，于－20℃保存?zhèn)溆?。本實驗PCR反應條件: 95℃變性20 s，然后60℃20 s和70℃1 s進行40個循環(huán)。采用ABI公司的7900型號Real-Time PCR儀器進行PC分析，結果采用2－ΔΔCt法進行相對定量分析。

1.4流式檢測外周血Th1、Th2細胞亞群外周血紅細胞裂解后，采用完全1640培養(yǎng)液調節(jié)濃度至1×106細胞/ml。在反應體系中加入1 μg/ml PMA、50 μg/ml離子霉素及1 μl/ml Golgistop，置培養(yǎng)箱中培養(yǎng)5 h。然后用2 ml磷酸鹽緩沖液(PBS) 洗1遍并重懸于100 μl PBS中，加入CD3e-APC(0.08 mg/ml) 和CD4-FITC(0.4 mg/ml)抗體，混勻后室溫避光孵育20 min。以2 ml PBS洗1遍，加入100 μl Fix/Perm A液并于室溫避光孵育20 min。離心清洗后加入100 μl Fix/Perm B液重懸細胞后，再加入抗干擾素(IFN) -γ-PE(0.1 mg/ml)及白細胞介素(IL) -14-PE(0.1 mg/ml)抗體，置4℃避光孵育30 min。用PBS洗1遍后，以400 μl PBS重懸細胞后，采用用流式細胞儀(FACSCalibur，美國BD公司)檢測分析。

1.5統(tǒng)計學分析應用SPSS13.0統(tǒng)計軟件進行t檢驗、Spearman相關分析以及Pearson相關分析。

2　結果

2.1胃癌組織及對應癌旁miRNA-21 mRNA的表達水平與癌旁組織(1.32±0.33)比較，miRNA-21在胃癌組織中的表達水平(4.01±0.61)顯著增加(t=35.20，P＜0.05)。

2.2胃癌患者血漿中miRNA-21 mRNA的表達水平與正常人群(1.21±0.41)比較，miRNA-21在胃癌患者血漿中mRNA表達水平(4.41±0.48)顯著增加(t=29.33，P＜0.05)。

2.3胃癌組織及血漿中miRNA-21表達水平與胃癌組織病理分級關系Spearman相關分析結果顯示，胃癌組織、血漿中miRNA-21 mRNA表達水平與胃癌的TNM分化程度呈顯著正相關(r = 0.674，0.681，均P＜0.05)。而胃癌的癌旁組織中miRNA-21 mRNA表達水平與TNM分化程度無顯著相關性(r= 0.249，P＞0.05)。見表1。

表1　組織和血漿中miRNA-21 mRNA表達與胃癌TNM分級的關系(±s)

表1　組織和血漿中miRNA-21 mRNA表達與胃癌TNM分級的關系(±s)

TNM分級n　　胃癌組織　　癌旁組織　　胃癌血漿Ⅰ　5　 1.33±0.32　 1.15±0.24　 1.41±0.36Ⅱ　9　 2.03±0.37　 1.09±0.23　 2.95±0.42Ⅲ　14　 4.89±0.56　 1.41±0.42　 4.72±0.59Ⅳ　12　 6.48±0.71　 1.35±0.53　 7.19±0.83

2.4胃癌血漿中miRNA-21表達水平與外周血Th2的關系Pearson相關分析結果顯示，胃癌患者血漿中miRNA-21 mRNA表達水平與胃癌患者外周血Th1細胞呈顯著負相關(r=0.554，P＜0.05)，而與Th2細胞呈顯著正相關(r=0.572，P＜0.05)。

3　討論

miRNA是一類全長為19～25 nt的單鏈小分子RNA，廣泛存在于組織、血清、血漿及其他體液中，并且在體內(nèi)表達比較穩(wěn)定。該分子本身不具有蛋白編碼功能，但對編碼蛋白基因的mRNA有重要調控作用〔5〕。

以往大量的研究認為miRNA表達異常和腫瘤的發(fā)生密切相關，其通過對機體內(nèi)抑癌或者促癌基因起著極其重要的調控作用〔6〕。目前，大量的研究認為miRNA-21在胰腺癌、結腸癌、口腔癌等癌癥組織中表達增加，表明miRNA-21可能在惡性腫瘤中起著重要的抑癌功能〔5〕。Chan等〔7〕用RT-PCR技術檢測了37例胃癌組織標本，發(fā)現(xiàn)有34例患者miRNA-21表達水平明顯高于正常胃組織。本研究結果證實了上述miRNA-21癌基因的作用。此外，本研究還進一步證實了miRNA-21在胃癌發(fā)生發(fā)展中可能的促進作用。

進一步相關分析結果顯示，miRNA-21可能影響著胃癌患者癌細胞的增殖能力和惡性程度，從而也提示了miRNA-21胃癌的診斷、分級以及預后評價可能起著潛在的重要作用。Meng等〔8〕學者在分析肝癌組織表達譜時發(fā)現(xiàn)miRNA-21高表達，且與肝癌組織的分級呈現(xiàn)顯著正相關，這也進一步佐證了本研究結果。有研究顯示，Th1以及Th2細胞的比例在胃癌的發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮重要的作用，其中Th1細胞具有抑制腫瘤生存的特征，而Th2細胞則能夠促進腫瘤生長〔9〕。本研究提示miRNA-21可能是通過影響患者體內(nèi)Th1/Th2平衡來促進腫瘤的生長。綜上所述，miRNA-21在胃癌的發(fā)生、發(fā)展中起著重要的作用，可能的機制是通過使得機體Th1/Th2平衡向Th2偏倚來實現(xiàn)的。miRNA-21的檢測對于對胃癌患者的臨床治療以及預后具有一定的指導意義。

4　參考文獻

1 Lu J，Getz G，Miska EA，et al．MicroRNA expression profiles classify human cancers〔J〕．Nature，2005; 435(7043) : 834-8.

2 Wang Z，Han J，Cui Y，et al．Circulating microRNA-21 as noninvasive predictive biomarker for response in cancer immunotherapy〔J〕．Med Hypotheses，2013; 81(1) : 41-3.

3Stintzing S，Lenz HJ.MicroRNA-21 in colorectal cancer:“Just another brick in the wall”〔J〕．J Natl Cancer Inst，2013; 105(12) : 840-1.

4 Chung WM，Chang WC，Chen L，et al．MicroRNA-21 promotes the ovarian teratocarcinoma PA1 cell line by sustaining cancer stem/progenitor populations in vitro〔J〕．Stem Cell Res Ther，2013; 4(4) : 88.

5 Lewis BP，Burge CB，Bartel DP.Conserved seed pairing，often flanked by adenosines，indicates that thousands of human genes are microRNA targets〔J〕．Cell，2005; 120(1) : 15-20.

6 Jiang J，Gusev Y，Aderca I，et al．Association of MicroRNA expression in hepatocellular carcinomas with hepatitis infection，cirrhosis，and patient survival〔J〕．Clin Cancer Res，2008; 14(2) : 419-27.

7 Chan SH，Wu CW，Li AF，et al．miR-21 microRNA expression in human gastric carcinomas and its clinical association〔J〕．Anticancer Res，2008; 28(2A) : 907-11.

8 Meng F，Henson R，Wehbe-Janek H，et al．MicroRNA-21 regulates expression of the PTEN tumor suppressor gene in human hepatocellular cancer〔J〕．Gastroenterology，2007; 133(2) : 647-58.

9 Hong S，Qian J，Yang J，et al．Roles of idiotype-specifict cells in myeloma cell growth and survival: Th1 and CTL cells are tumoricidal while Th2 cells promote tumor growth〔J〕．Cancer Res，2008; 68(20) : 8456-64.

〔2015-01-11修回〕

(編輯袁左鳴/滕欣航)

〔中圖分類號〕R73

〔文獻標識碼〕A

〔文章編號〕1005-9202(2015) 16-4475-02;

doi:10.3969/j.issn.1005-9202.2015.16.024