劉寶華　李海峰　胡克邦　劉海波(吉林大學第一醫(yī)院二部，吉林　長春　130031)

褪黑素對創(chuàng)傷性腦損傷大鼠ERK-MAPK信號傳導機制的影響

劉寶華李海峰胡克邦劉海波
(吉林大學第一醫(yī)院二部，吉林長春130031)

〔摘要〕目的探討褪黑素(MT)對創(chuàng)傷性腦損傷(TBI)急性期ERK-絲裂原活化蛋白酶(ERK-MAPK)信號通路的影響。方法制作大鼠創(chuàng)傷性腦損傷模型，打擊損傷前30 min自尾靜脈注射MT。細胞凋亡原位檢測(TUNEL)熒光法檢測細胞凋亡，Western印跡法檢測損傷腦皮質pERK表達水平。結果TUNEL熒光法檢測顯示TBI+MT組損傷灶周圍皮層TUNEL陽性細胞少于TBI組，凋亡指數降低(P＜0.05)。Western印跡法檢測腦損傷后各個時間點pERK表達，在損傷后1 h起迅速升高，3 d為表達高峰，其后逐漸下降，但直到損傷后5 d仍未恢復至基礎水平。TBI+MT組pERK水平較TBI組明顯降低(P＜0.01)，而且MT 20 mg/kg組的pERK1/2水平低于10 mg/kg組(P＜0.05)。結論創(chuàng)傷性腦損傷誘導了強烈的ERKMAPK信號通路激活，MT能夠劑量依賴性抑制ERK1/2-MAPK信號通路激活，并抑制急性期神經細胞凋亡。

〔關鍵詞〕創(chuàng)傷性腦損傷; MAPK;信號傳導

第一作者:劉寶華(1977-)，男，博士，主治醫(yī)師，主要從事急重癥醫(yī)學的研究。

交通事故、意外傷害所致的創(chuàng)傷性腦損傷(TBI)的發(fā)生率逐年升高，主要的病理生理機制是缺血性腦損傷和繼發(fā)的遲發(fā)性損傷，其死亡率和致殘率高，然而臨床安全和有效的干預措施仍有待于進一步的研究。褪黑素(MT)是普遍存在于生物體的一種吲哚胺類激素、進化保留因子，在體內引起多種生物效應，包括調節(jié)生物節(jié)律、神經內分泌-免疫系統(tǒng)等重要作用〔1〕。近年來研究發(fā)現(xiàn)MT具有很強的自由基清除作用及抗氧化作用，本實驗觀察MT對TBI大鼠絲裂原活化蛋白酶(MAPK)信號傳導機制的影響及變化，旨在探討MT的腦保護作用機制。

1　材料與方法

1.1試劑MT: Alexis公司產品，使用前先溶于無水乙醇，繼以生理鹽水稀釋。細胞凋亡原位檢測(TUNEL)試劑盒為瑞士Roche公司產品，兔抗phospho-ERK1/2抗體(1∶800，Cell Signaling，美國)、兔抗ERK1/2抗體(1∶800，Cell Signaling，美國)。

1.2大鼠TBI模型的建立選用成年健康SD大鼠125只，每只約250～300 g，雌雄兼用，由吉林大學基礎醫(yī)學院實驗動物中心提供。自然光照周期飼養(yǎng)，術前12 h禁食，自由飲水。SD大鼠稱重后經2％戊巴比妥鈉50 mg/kg腹腔注射麻醉后，俯臥固定于腦立體定位儀上。矢狀中線切開頭皮后分離骨膜，暴露前囟、冠狀縫和矢狀縫及頂骨。以前囟后310 mm，向右旁開矢狀縫310 mm為中心作一直徑約為4～5 mm顱骨鉆孔。保持硬腦膜不受損傷。采用Feeney法制作大鼠中度腦損傷模型，落體致傷的沖擊力為40 g×25 cm。將自由落體裝置底座置于右頂骨窗部的硬腦膜表面，以40 g重物自25 cm高沿套管下落打擊致傷，造成右頂局限性損傷。

1.3動物分組125只大鼠隨機分為5組，每組25只:①假手術(Sham)組:手術操作同其他組，但僅作頭皮切口，開顱骨窗不致腦損傷;②TBI組:于損傷前30 min靜脈注射等體積生理鹽水;③TBI + MT 5 mg/kg (MT5)組;④TBI + MT 10 mg/kg (MT10)組;⑤TBI+MT 20 mg/kg(MT20)組。③～⑤組于外傷前30 min靜脈注射MT 1次。TBI組和TBI+MT組又按取材時間的不同分為傷后1、6 h、1、3、5 d共5個分析時相點，每個時相點5只。

1.4TUNEL熒光法檢測細胞凋亡取經TBI區(qū)域皮質，新鮮冰凍切片制備連續(xù)冠狀切片(厚度5 mm)，按德國BM公司TUNEL試劑盒說明書操作，進行切片的TUNEL熒光染色。光鏡下監(jiān)測染色。每個切片觀察受傷灶中心皮質、皮層下白質、海馬、齒狀回及對側相應部位腦組織，細胞核著綠色熒光(TUNEL陽性)和藍色熒光(DAPI陽性)者為陽性細胞，即凋亡細胞。熒光顯微鏡下(10目鏡×20物鏡)每張切片隨機選取3個無重疊視野，采用Image-ProPlus6.0圖像分析軟件分別計數DAPI染色陽性細胞和TUNEL染色陽性細胞數并計算神經細胞凋亡指數(AI) (％)，即凋亡細胞占視野總細胞數的百分比。

1.5Western印跡檢測TBI腦組織pERK1/2表達在各個相應時間點，實驗大鼠以10％水合氯醛(300 mg/kg)腹腔注射麻醉，快速斷頭取腦，冠狀切取頂葉皮層約100 mg，迅速剪碎，加入1 ml細胞裂解液，冰浴中勻漿，4℃，12 000 r/min離心15 min，取上清液，Bradford法測定蛋白濃度。加入等體積2×十二烷基硫酸鈉(SDS)上樣緩沖液，煮沸10 min，10 000 r/min離心5 min。取樣本30 μg進行10％聚丙烯酰胺凝膠電泳，轉移到聚偏氟丙烯(PVDF)膜，麗春紅染色觀察轉移效果，根據標準分子量蛋白確定待測蛋白的條帶位置。含5％脫脂奶粉的磷酸鹽緩沖液(PBS)液封閉2 h，按0.5 μg/ml濃度加入兔抗pERK1/2多克隆抗體，4℃孵育過夜，加入羊抗兔辣根過氧化物酶標記的IgG(1∶2 000)，室溫搖育1 h，洗滌后用增強化學發(fā)光試劑暗室內膠片曝光。用Gelwork4.0圖像分析系統(tǒng)測定目的條帶的吸光度值。以β-tublin(47 kD)為內參照，根據目的條帶與β-tublin條帶吸光度的比值表示待測蛋白含量。

1.6統(tǒng)計學方法采用SPSS18.0統(tǒng)計學分析軟件對各組數據的組間比較進行t檢驗。

2　結果

2.1TUNEL熒光法檢測MT對TBI后細胞凋亡影響情況TBI后1 h～5 d細胞凋亡檢測顯示，對照組(Sham組)和損傷組(TBI組)對側腦組織未見或僅有極少量的凋亡細胞。壞死細胞(Ⅰ型細胞)主要集中在傷灶中心皮質，片狀分布;凋亡細胞(Ⅱ型細胞)呈散在分布，相對集中于傷灶與正常組織交界的皮層、皮層下白質、海馬和齒狀回。傷后1 h傷側腦組織即出現(xiàn)凋亡細胞，AI值與對照組相比差異顯著(P＜0.05)，并隨時間延長數量逐漸增多，其峰值出現(xiàn)在1 d，隨后緩慢下降，但5 d時仍高于正常水平。TBI組較Sham組AI顯著提高(P＜0.01)，而TBI +MT組較TBI組損傷灶周圍皮質TUNEL陽性細胞少于TBI組，AI顯著降低(P＜0.05)，其中TBI+MT20組降低程度最明顯(P＜0.01)。見圖1。

圖1　TUNEL檢測MT對TBI后細胞凋亡的影響

2.2Western印跡檢測MT對TBI各組pERK1/2在腦組織內表達的影響pERK1/2表達水平在TBI后顯著升高，并且在1 h和6 h持續(xù)高表達。TBI后MT治療組pERK1/2水平較TBI組明顯降低(P＜0.01)，MT 20 mg/kg組的pERK1/2水平低于10 mg/kg組(P＜0.05)。見圖2。

圖2　Western印跡檢測MT對TBI各組PERK1/2在腦組織內表達的影響

3　討論

TBI是一類嚴重的閉合性腦損傷，具有較高死亡率和致殘率，其急性期治療的重點在于減輕繼發(fā)性腦損傷的程度。繼發(fā)性腦損傷是一個復雜的病理過程，包括興奮性氨基酸釋放、炎性細胞因子產生、MAPK信號傳導通路激活和細胞凋亡等。這些病理變化的產生和發(fā)展都需要經過細胞信號傳導來完成，因此從細胞信號傳導通路的關鍵環(huán)節(jié)來下調過度的細胞反應可能會為TBI的治療提供新的思路。

近期研究發(fā)現(xiàn)，ERK-MAPK通路在局灶性顱腦損傷、腦缺血的繼發(fā)病理改變中發(fā)揮了重要作用〔2〕。ERK1/2通路是將細胞外信號向細胞內傳導的重要通路之一，各種細胞外信號先作用于細胞表面的受體，依次激活Ras、Raf-1及MEK，并進一步將ERK1/2磷酸化，pERK1/2從細胞質轉移至細胞核，調節(jié)即刻反應基因和晚反應基因的表達，影響細胞的狀態(tài)和功能。其中ERK1/2處于關鍵環(huán)節(jié)，可通過被磷酸化而活化，pERK1/2的表達可反映ERK1/2通路的活化水平。

ERK1/2磷酸化可以激活前凋亡轉錄因子，與其早期基因介導炎癥和凋亡有關。MT是一種強效自由基清除劑，可以有效對抗氧離子和ONOO－〔3〕。電生理學研究證實其可以抑制大腦內N-甲基-D-天冬氨酸(NMDA)受體介導的活性。通過氧化還原反應阻止nNOS活性和NO產生〔4〕。ERK1/2在TBI后被激活，其磷酸化過程收到細胞因子和自由基調控，可以緩解缺血損傷，而ERK1/2活性由外源性刺激產生神經保護作用。國外研究發(fā)現(xiàn)選擇性突觸外NMDA受體激活不激活體外ERK途徑，但可以誘導維持ERK激活狀態(tài)〔5〕。

本研究提示MT可以劑量依賴性抑制ERK1/2信號通路激活，并抑制急性期神經細胞凋亡，從而保護腦組織避免繼發(fā)性損傷。MAPK信號轉導通路在TBI的分子學機制中發(fā)揮了一定作用，MT可以有效抑制MAPK信號傳導通路的激活，對TBI具有一定的保護作用。

4　參考文獻

1Carbonell WS，Mandell JW.Transient neuronal but persistent astroglial activation of ERK/MAP kinase after focal brain injury in mice〔J〕．J Neurotrauma，2003; 20(4) : 327-36.

2 Grethe S，Porn-Ares MI.p38 MAPK regulates phosphorylation of Bad via PP2A-dependent suppression of the MEK1/2-ERK1/2 survival pathwayin TNF-alpha induced endothelial apoptosis〔J〕．Cell Signal，2006; 18 (4) : 531-40.

3 Koh PO.Melatonin attenuates the focal cerebral ischemic injury by inhibiting the dissociation of pBad〔J〕．J Pineal Res，2008; 44(1) : 101-6.

4 Lipton SA.Failures and successes of NMDA receptor antagonists: molecular basis for the use of open-channel blockers like memantine in the treatment of acute and chronic neurologic insults〔J〕．Neuro Rx，2004; 1(1) : 101-10.

5 Vaz AR，Silva SL，Barateiro A，et al.Pro-inflammatory cytokines intensify the activation of NO /NOS，JNK1/2 and caspase cascades in immature neurons exposed to elevated levels of unconjugated bilirubin〔J〕．Exp Neurol，2011; 229(2) : 381-90.

〔2014-12-11修回〕

(編輯袁左鳴/滕欣航)

通訊作者:劉海波(1972-)，男，副主任醫(yī)師，主要從事急重癥醫(yī)學的研究。

基金項目:吉林大學第一醫(yī)院二部科研專項基金(2013年)

〔中圖分類號〕R651.1

〔文獻標識碼〕A

〔文章編號〕1005-9202(2015) 16-4473-03;

doi:10.3969/j.issn.1005-9202.2015.16.023