蔣魯勇　顏勇卿　余　霄　龐清江(寧波大學(xué)醫(yī)學(xué)院，浙江　寧波　352)

人工重組促紅細(xì)胞生成素對(duì)激素沖擊大鼠股骨頭壞死的預(yù)防作用

蔣魯勇顏勇卿1余霄1龐清江1
(寧波大學(xué)醫(yī)學(xué)院，浙江寧波315211)

〔摘要〕目的探討人工重組促紅細(xì)胞生成素(rHuEPO)對(duì)激素沖擊大鼠缺血性股骨頭壞死的預(yù)防作用。方法健康成年Wistar大鼠24只，雌雄各半。隨機(jī)分為三組。陽(yáng)性對(duì)照組:大鼠后腿肌注地塞米松(Dex) 1 mg/kg體重(BW)，2次/w，連續(xù)5 w;陰性對(duì)照組:同樣方法注射生理鹽水;實(shí)驗(yàn)組:大鼠后腿肌注Dex 1 mg/kg BW，2次/w，連續(xù)5 w，并且每日腹腔內(nèi)注射500 U/kg體重rHuEPO至5 w。制模后全部處死取材，取雙側(cè)股骨頭標(biāo)本，一側(cè)切片后HE染色，并用光學(xué)顯微鏡觀察骨組織、骨髓組織、骨小梁結(jié)構(gòu)變化。另一側(cè)切片后免疫組化法CD31染色觀察微血管變化。結(jié)果陽(yáng)性對(duì)照組HE染色發(fā)現(xiàn)骨小梁明顯稀疏、變窄，形態(tài)不規(guī)則，骨小梁分割程度下降并伴有較多破骨細(xì)胞出現(xiàn)，部分可見(jiàn)骨細(xì)胞胞核皺縮、溶解、消失。而實(shí)驗(yàn)組較陽(yáng)性對(duì)照組，病變明顯減輕，骨小梁形態(tài)較為規(guī)則，小梁連接程度明顯優(yōu)于陽(yáng)性對(duì)照組，部分骨小梁較粗，斷裂明顯減少，骨小梁分割程度較高且可見(jiàn)較多成骨細(xì)胞。免疫組化測(cè)CD31顯示陽(yáng)性對(duì)照組CD31表達(dá)要明顯低于陰性對(duì)照組與實(shí)驗(yàn)組(P＜0.05)。結(jié)論rHuEPO可以有效地預(yù)防骨細(xì)胞凋亡，延緩或降低股骨頭壞死的發(fā)生。

〔關(guān)鍵詞〕人工重組促紅細(xì)胞生成素;激素;股骨頭壞死

1寧波第二醫(yī)院骨科中心

第一作者:蔣魯勇(1988-)，男，碩士，住院醫(yī)師，主要從事骨關(guān)節(jié)疾病研究。

激素性股骨頭壞死(SANFH)不僅起病快，進(jìn)程快，預(yù)后差，而且還具有易致股骨頭塌陷及致殘率高等臨床特點(diǎn)。SANFH發(fā)病的最終因素是其股骨頭內(nèi)部出現(xiàn)供血不足的現(xiàn)象，并且血運(yùn)重建受到障礙，最終造成骨細(xì)胞壞死〔1～4〕。因此，治療股骨頭缺血性壞死的關(guān)鍵就是促進(jìn)壞死區(qū)血管再生和新骨形成。促紅細(xì)胞生成素(EPO)是一種分子量約30 kD、熱穩(wěn)定(80℃)的單鏈酸性糖蛋白。研究證實(shí)，EPO不但能夠有效促進(jìn)紅細(xì)胞生成，同時(shí)還有保護(hù)細(xì)胞的作用，特別是能夠阻止內(nèi)皮細(xì)胞、神經(jīng)細(xì)胞和心肌細(xì)胞凋亡，促進(jìn)新生血管的生成〔5〕。本研究旨在探討人工重組(rHu) EPO對(duì)激素沖擊大鼠缺血性股骨頭壞死的預(yù)防作用。

1　材料與方法

1.1大鼠激素性股骨頭缺血性壞死模型的建立健康成年Wistar大鼠24只，雌雄各半，體重約為300 g。均在同一條件下飼養(yǎng)，均采用普通顆粒飼料，采取自然光照，溫度(20±2)℃，濕度50％左右。1 w后稱(chēng)重，隨機(jī)分為陽(yáng)性對(duì)照組、陰性對(duì)照組、實(shí)驗(yàn)組，每組8只，雌雄各半。3組體重?zé)o統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＞0.05)。均符合2006年科學(xué)技術(shù)部發(fā)布的《關(guān)于善待實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的指導(dǎo)性意見(jiàn)》。陽(yáng)性對(duì)照組:后腿肌注地塞米松(Dex) 1 mg/kg體重，2次/w，連續(xù)用藥5 w;陰性對(duì)照組同樣方法注射等量生理鹽水;實(shí)驗(yàn)組后腿肌注Dex 1 mg/kg體重，2次/w，連續(xù)5 w，并且每日腹腔內(nèi)注射500 U/kg體重rHuEPO至5 w。

1.2大體觀察每天注意觀察生命狀態(tài)、進(jìn)食情況、體重、精神狀態(tài)、排泄情況及有無(wú)體表感染等，準(zhǔn)確稱(chēng)重。為了增加動(dòng)物的活動(dòng)量，實(shí)行每天定時(shí)活動(dòng)2 h，盡可能使模型的建立更加合理。

1.3HE染色5 w后各組麻醉后放血處死，切取雙側(cè)股骨頭標(biāo)本用于HE染色及免疫組化檢測(cè)CD31。進(jìn)行取材標(biāo)本時(shí)小心剔除周?chē)浗M織，仔細(xì)注意股骨頭是否光滑完整，形態(tài)是否正常及冠狀面的色澤、切開(kāi)時(shí)阻力大小等等。將所取標(biāo)本用10％中性甲醛溶液(0.1 mol/L，pH7.4) 4℃固定4 d，然后PBS溶液沖洗，放在緩沖液大約10％乙二胺四乙酸(EDTA-Tris)溶液里，37.4℃脫鈣，該方法實(shí)行每周1次，仔細(xì)注意骨表面的顏色，并且采用物理法準(zhǔn)確測(cè)量脫鈣程度。如果完全脫鈣后進(jìn)行取材，乙醇對(duì)梯度逐級(jí)脫水，二甲苯透明處理2 h，用石蠟包埋，切開(kāi)片面后行HE染色。利用在光學(xué)顯微鏡下觀察骨組織、骨髓組織、骨小梁結(jié)構(gòu)變化。

1.4免疫組化測(cè)定CD31取相應(yīng)的股骨頭標(biāo)本，沿冠狀面縱行剖開(kāi)，給予多聚甲醛固定液大約40 g/L中，放在4℃冰箱內(nèi)，放置48 h，石蠟切片SP免疫組化。CD31陽(yáng)性信號(hào)定位于血管內(nèi)皮細(xì)胞質(zhì)，呈棕黃色顆粒。在顯微鏡下觀察，隨機(jī)抽取3個(gè)每張免疫組化切片不同視野(×400)計(jì)數(shù)呈棕黃色的陽(yáng)性表達(dá)血管。

1.5統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SPSS18.0統(tǒng)計(jì)學(xué)分析軟件對(duì)數(shù)據(jù)的組間比較進(jìn)行t檢驗(yàn)。

2　結(jié)果

2.1一般情況各組大鼠狀態(tài)良好。5 w后陽(yáng)性對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組大部分后肢和背部毛發(fā)脫落、稀疏;而陰性對(duì)照組毛發(fā)無(wú)明顯改變。整個(gè)實(shí)驗(yàn)期間，無(wú)動(dòng)物死亡，陽(yáng)性對(duì)照組有部分動(dòng)物活動(dòng)減少，食欲可;其余兩組未見(jiàn)明顯異常。

2.2HE染色結(jié)果①陰性對(duì)照組:雄性和雌性大鼠骨小梁結(jié)構(gòu)完整，呈圓形或橢圓形拱形結(jié)構(gòu)，骨小梁連接性高，骨髓造血細(xì)胞豐富，脂肪細(xì)胞相對(duì)少，無(wú)破骨細(xì)胞和骨小梁變窄、斷裂出現(xiàn)。②陽(yáng)性對(duì)照組:雄性中3只大鼠可見(jiàn)骨小梁明顯稀疏、變窄、斷裂、連接率降低，部分拱形結(jié)構(gòu)消失，形態(tài)不規(guī)則，骨小梁分割程度下降并伴有較多破骨細(xì)胞出現(xiàn)，部分可見(jiàn)骨細(xì)胞核皺縮、溶解、消失;雌性中有3只可見(jiàn)上述病變。其他2只均有不同程度的骨小梁變窄、連接率降低等病變產(chǎn)生。③實(shí)驗(yàn)組:較陽(yáng)性對(duì)照組，雄性和雌性病變明顯減輕，骨小梁形態(tài)較為規(guī)則，小梁連接程度明顯優(yōu)于陽(yáng)性對(duì)照組，部分骨小梁變粗，斷裂明顯減少，缺損處出現(xiàn)連接和修復(fù)，部分結(jié)構(gòu)接近正常組，骨小梁分割程度較高且可見(jiàn)較多成骨細(xì)胞。見(jiàn)圖1。

圖1　各組股骨頭的組織病理學(xué)變化

2.3免疫組化檢測(cè)CD31的表達(dá)CD31抗體免疫組化染色能清晰地選擇性地顯示血管內(nèi)皮細(xì)胞，呈棕黃色顆粒，而其他組織不著色。顯微鏡下隨機(jī)視野計(jì)數(shù)血管染色后。與陰性對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組比較，陽(yáng)性對(duì)照組CD31低表達(dá)，見(jiàn)表1。①陰性對(duì)照組: CD31表達(dá)豐富，股骨頭血供充足，微循環(huán)正常;②陽(yáng)性對(duì)照組: CD31染色計(jì)數(shù)明顯減少，棕黃色較淡，提示微循環(huán)不足，股骨頭血供下降明顯(P＜0.001) ;③實(shí)驗(yàn)組:相比陽(yáng)性對(duì)照組CD31染色計(jì)數(shù)增多，血供相對(duì)增加(P＜0.05)。見(jiàn)圖2。

表1　各組股骨CD31的表達(dá)染色計(jì)數(shù)(±s，n=4)

表1　各組股骨CD31的表達(dá)染色計(jì)數(shù)(±s，n=4)

與陰性對(duì)照組比較: 1) P＜0.001;與陽(yáng)性對(duì)照組比較: 2) P＜0.05，3) P＜0.01

組別　　雄　　雌陰性對(duì)照組　26.00±6.02　27.67±7.99陽(yáng)性對(duì)照組　12.72±3.391)　14.11±5.021)實(shí)驗(yàn)組　15.61±3.132)　18.94±4.223)

圖2　各組免疫組化檢測(cè)CD31結(jié)果(×400)

3　討論

胡長(zhǎng)根等〔6〕發(fā)現(xiàn)激素可誘導(dǎo)微血管內(nèi)皮細(xì)胞的凋亡引起毛細(xì)血管數(shù)量減少，可能誘導(dǎo)微循環(huán)障礙。當(dāng)長(zhǎng)期大劑量使用糖皮質(zhì)激素時(shí)，隨著股骨頭微血管密度(MVD)的下降，血流灌注量逐漸減少，股骨頭血流量逐漸下降，隨著血流量用藥時(shí)間的延長(zhǎng)而進(jìn)一步降低。導(dǎo)致骨組織細(xì)胞缺血，發(fā)生缺氧及各系細(xì)胞發(fā)生脂肪變性。當(dāng)缺血和缺氧到達(dá)某一閾值時(shí)即發(fā)生骨壞死。目前有多種保頭的治療方法，其中髓芯減壓是目前比較常用的方法。該方法的主要機(jī)制在于能夠逐漸恢復(fù)股骨頭的血液循環(huán)，減少股骨頭內(nèi)的壓力，采用髓芯鉆孔減壓，能夠減輕骨髓水腫同時(shí)還能有效改善股骨頭血液循環(huán)、最終達(dá)到治愈疾病的目的。

EPO能夠促進(jìn)網(wǎng)織紅細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞的增殖分化，刺激形成血管及再生細(xì)胞，具有抗細(xì)胞凋亡、抗炎、抗氧化、血管生成及促進(jìn)細(xì)胞增殖和保護(hù)作用。一方面EPO能夠抗氧化、抗細(xì)胞凋亡、調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)、減輕心腎組織損傷和促血管新生等多方面的骨髓造血以外的功能，另一方面，增加紅細(xì)胞生成來(lái)提高組織氧灌注，因此影響慢性心力衰竭和腎功能不全的組織重塑和纖維化進(jìn)程〔5，7〕。研究表明，心力衰竭伴貧血的患者，使用EPO治療貧血可能改善心功能，降低其住院率〔8〕。張嘉熙等〔9〕通過(guò)體外培養(yǎng)小鼠骨髓基質(zhì)細(xì)胞系(ST2)，加入EPO后，采用實(shí)時(shí)PCR方法檢測(cè)成骨細(xì)胞相關(guān)基因的表達(dá)，結(jié)果顯示EPO組與對(duì)照組相比，鈣沉積明顯增多，成骨相關(guān)基因的表達(dá)也增高，得出EPO對(duì)成骨細(xì)胞的分化和功能有明顯的促進(jìn)作用。Hu等〔10〕發(fā)現(xiàn)EPO可通過(guò)抑制p38MAPK活化、降低腫瘤壞死因子(TNF) -α水平、減輕炎性損傷等顯著改善大鼠腎臟缺血再灌注損傷后的腎功能異常，對(duì)腎移植后早期腎功能恢復(fù)提供了幫助。Ishii等〔11〕發(fā)現(xiàn)EPO預(yù)處理可減少腦梗死面積和神經(jīng)細(xì)胞凋亡的數(shù)量，從而減輕大鼠腦缺血再灌注損傷。Ahn等〔12〕研究表明EPO能促進(jìn)血管生成、改善血液流動(dòng)，能有效改善小鼠下肢循環(huán)，為臨床恢復(fù)急性動(dòng)脈栓塞后的血液灌注提供新的思路和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。本實(shí)驗(yàn)說(shuō)明rHuEPO可以減少骨細(xì)胞凋亡，進(jìn)而阻止股骨頭壞死的發(fā)生。由此推測(cè)rHuEPO可能通過(guò)微循環(huán)的改善，實(shí)現(xiàn)預(yù)防股骨頭壞死。采用rHuEPO進(jìn)行治療，短期效果明顯，但是長(zhǎng)期療效和預(yù)防作用的機(jī)制還需深入探討。

4　參考文獻(xiàn)

1焦慶豐.激素性股骨頭壞死發(fā)病機(jī)制的研究進(jìn)展〔J〕．臨床骨科雜志，2010; 13(3) : 329-31.

2薛元鎖，時(shí)述山，李亞非，等．激素性股骨頭壞死病程中骨形態(tài)發(fā)生蛋白－2的改變及其意義〔J〕．中華實(shí)驗(yàn)外科雜志，2000; 17(5) : 455-6．

3吳星火，楊述華.脂肪組織巨噬細(xì)胞在激素性股骨頭壞死發(fā)病機(jī)制及治療中的作用〔J〕．中華骨科雜志，2013; 33(7) : 776-8.

4王玉輝，劉又文.激素性股骨頭壞死發(fā)病機(jī)制的研究進(jìn)展〔J〕．中醫(yī)臨床研究，2012; 21(1) : 121-2.

5 Holstein JH，Orth M，Scheuer C，et al.Erythropoietin stimulates bone formation，cell proliferation and angiogenesis in a femoral segmental defect model in mice〔J〕．Bone，2011; 49(5) : 1037-45.

6胡長(zhǎng)根，陳君長(zhǎng).激素對(duì)股骨頭微血管及組織細(xì)胞的影響〔J〕．中華骨科雜志，2004; 24(6) : 359-63.

7楊元生，陳墾，石星亮，等.促紅細(xì)胞生成素的臨床應(yīng)用進(jìn)展〔J〕．中華全科醫(yī)學(xué)，2009; 7(9) : 992-4.

8 Ngo K，Kotecha D，Walters JA，et al.Erythropoiesis-stimulating agents for anaemia in chronic heart failure patients〔J〕．Cochrane Database Syst Rev，2010; 12(2) : 123-6.

9張嘉熙，史冊(cè)，劉姍姍，等.促紅細(xì)胞生成素促進(jìn)骨髓基質(zhì)細(xì)胞成骨分化的實(shí)驗(yàn)研究〔J〕．口腔頜面外科雜志，2014; 24(1) : 21-6.

10 Hu L，Yang C，Zhao T，et al.Erythropoietin ameliorates renal ischemia and reperfusion injury via inhibiting tubulointerstitial inflammation〔J〕．J Surg Res，2012; 176(1) : 260-6.

11 Ishii T，Asai T，F(xiàn)ukuta T，et al.A single injection of liposomal asialoerythropoietin improves motor function deficit caused by cerebral ischemia/reperfusion〔J〕．Int J Pharm，2012; 439(1-2) : 269-74.

12 Ahn S，Min SK，Min SI，et al.Early sustained injections of erythropoietin improve angiogenesis and restoration of perfusion in the ischemic mouse hindlimb〔J〕．J Korean Med Sci，2012; 27(9) : 1073-8.

〔2014-06-19修回〕

(編輯苑云杰)

通訊作者:龐清江(1963-)，男，博士，碩士生導(dǎo)師，主任醫(yī)師，主要從事人工關(guān)節(jié)、骨質(zhì)疏松研究。

基金項(xiàng)目:浙江省自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(No．LY12H06002)

〔中圖分類(lèi)號(hào)〕R68

〔文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼〕A

〔文章編號(hào)〕1005-9202(2015) 16-4471-03;

doi:10.3969/j.issn.1005-9202.2015.16.022