孔令菊　周　靜　趙　剛　姚素艷　鄭德宇(遼寧醫(yī)學院病理生理學教研室，遼寧　錦州　121001)

GAD65基因特異siRNA的構建和功能檢測

孔令菊周靜趙剛姚素艷鄭德宇
(遼寧醫(yī)學院病理生理學教研室，遼寧錦州121001)

〔摘要〕目的構建GAD65基因特異的siRNA并檢測體外功能。方法應用RT-PCR方法克隆大鼠GAD65基因、測序、重組病毒包裝檢測體外功能。針對GAD65基因的編碼區(qū)，設計3條siRNA片段及一條對照片段，將其分別亞克隆于siRNA的慢病毒表達載體并小量包裝獲得病毒顆粒(LV-GFP-siRNA-rGAD65) ;用siRNA病毒顆粒感染GAD65過表達的293細胞，檢測GAD65表達情況，從中篩選出高效特異的siRNA。大量包裝特異的siRNA病毒顆粒，在體外感染培養(yǎng)的大腦皮質細胞，在體內注射到SD大鼠的蒼白球內側部，檢測rGAD65的表達水平，觀察siRNA的功能。結果應用RT-PCR方法克隆rGAD65基因，其序列與GenBank中的基因序列幾乎一致(99.72％)，包裝病毒后在293細胞中過表達。篩選出針對rGAD65的高效特異的siRNA，在GAD65基因的沉默效率可達到66％。在體外、體內分別應用Western印跡檢測感染了LV-GFP-siRNA3-rGAD65的大腦皮質細胞和定點注射了LV-GFP-siRNA3-rGAD65的大鼠GPi。結論成功克隆rGAD65基因，設計、篩選出高效特異的siRNA，并證明這種siRNA在體內和體外均能有效地沉默rGAD65的表達。

〔關鍵詞〕谷氨酸脫羧酶;小干擾RNA;基因沉默

第一作者:孔令菊(1985-)，女，主要從事神經(jīng)退行性病變的研究。

帕金森病(PD)是常見于中老年人的神經(jīng)退行性病變，主要病理特征是中腦黑質多巴胺(DA)能神經(jīng)元變性缺失。黑質對大腦皮質-基底節(jié)-丘腦-皮質環(huán)路起重要的調節(jié)作用〔1〕?；坠?jié)環(huán)路的主要輸出核團黑質網(wǎng)狀部(SNr)和蒼白球內側部(GPi)的神經(jīng)遞質為γ-氨基丁酸(GABA)，谷氨酸在谷氨酸脫羧酶(GAD)的催化下脫羧生成GABA。有人將GAD的反義RNA定點注入GPi，結果顯示具有改善PD動物模型運動癥狀的作用〔2〕。但反義核酸需要大量核酸且效果不持久，不具有放大效應。受此啟發(fā)，如果應用RNAi技術沉默GPi和SNr的GAD基因的表達，減少GPi和SNr神經(jīng)末稍釋放GABA的量，使丘腦腹前核(VA) /丘腦腹外側核(VL)過度抑制情況得到緩解，可能會重新建立一種大腦基底神經(jīng)環(huán)路的平衡，在理論上應具有較好的改善PD動物模型運動癥狀和恢復大腦基底神經(jīng)環(huán)路平衡的作用。為此，我們克隆大鼠GAD基因，針對GAD基因的編碼區(qū)，設計siRNA并將其克隆于siRNA表達載體;并篩選高效特異的siRNA，在體內外分別檢測siRNA的作用。

1　材料和方法

1.1實驗材料包裝細胞293T細胞株(中科院上海細胞所)、大腸桿菌菌株DH5α(Invitrogen)、胰蛋白酶(Invitrogen)、限制性內切酶(Fermentas)、T4 DNA連接酶(NEB)、質粒DNA提取試劑盒(Axygen)、rGAD65單克隆抗體(Sigma)、制備感受態(tài)試劑盒(Biosciences)、凝膠回收試劑盒(Qiagen公司)。

1.2實驗方法

1.2.1rAAV2-rGAD65的構建、包裝參考GenBank登錄的大鼠谷氨酸脫羧酶(rat GAD，rGAD) mRNA的序列(NM-000818) 和T載體的酶切位點進行包括全部CDS區(qū)設計上、下游引物，上游引物: 5＇-GCCCCGGGATGGCATCTCCGGGCTCTGGCTTTTG-3＇，在上游引物中設計5＇插入SmaⅠ酶切位點。下游引物: 5＇-GCGGTACCCTATAAATCTT GTCCAAGGCGTTC-3＇。在下游引物3＇設計插入KpnI酶切位點。應用RT-PCR的方法獲得rGAD65基因，經(jīng)SmaⅠ和KpnⅠ雙酶切rGAD65和T載體，將基因克隆到T載體上，經(jīng)酶切鑒定正確的質粒送生物公司測序，結果與GenBank上的rGAD65 cDNA序列進行比對。將序列正確的rGAD65基因亞克隆到AAV載體上并進行rAAV-rGAD65重組病毒顆粒的包裝。檢測病毒的滴度，備用。應用10 IPO的濃度感染293細胞，篩選后獲得穩(wěn)定表達GAD65的293細胞。

1.2.2特異siRNA的設計、構建根據(jù)rGAD65基因序列，共設計3條siRNA分子及一條對照分子，通過BLAST驗證該序列對于任何基因無干擾效果，設計引物和酶切位點，其中l(wèi)oop結構選用了TTCAAGAGA。并將獲得的正確的siRNA序列亞克隆于siRNA表達載體LV-GFP-CTB上，分別計為LV-GFP-siRNA1-GAD65、LV-GFP-siRNA2-GAD65、LV-GFP-siRNA3-GAD65和LV-GFP-siRNAneg-GAD65，與包裝載體pGag/Pol、pRev、pVSV-G共轉染293T細胞，小量包裝病毒。用獲得的重組干擾病毒分別轉染GAD65過表達的293細胞，檢測GAD65表達情況，從中篩選出高效特異的siRNA。

1.2.3siRNA的包裝、沉默效率的病毒滴度的檢測選擇干擾效率高的序列，應用慢病毒包裝系統(tǒng)進行大量包裝，包裝后的病毒經(jīng)高速離心和冷凍干燥濃縮近1 000倍后進行病毒滴度的檢測。應用原始病毒，依次進行10倍稀釋，從10－4直至10－10，應用不同稀釋倍數(shù)的病毒液感染A549細胞，根據(jù)A549熒光細胞數(shù)計算病毒的滴度。

1.2.4siRNA的功能檢測體外培養(yǎng)大腦皮質細胞，分別應用LV-GFP-siRNA3-GAD65和LV-GFP-siRNAneg-GAD65病毒顆粒10 IPO感染培養(yǎng)的大腦皮質細胞，應用Western印跡的方法檢測在感染1 w后大腦皮質細胞中GAD65基因的表達水平。將105個病毒顆粒(LV-GFP-siRNA3-GAD65、LV-GFP-siRNAneg-GAD65和等體積的PBS)定點注射到SD大鼠蒼白球的內側部，1 w后，大鼠斷頸處死，在冰上迅速剝出大腦，在解剖顯微鏡下分離出雙側的蒼白球外側部，應用Western印跡的方法檢測GAD65的表達水平。

2　結果

2.1rGAD65基因克隆應用RT-PCR方法從大鼠大腦皮質中克隆出rGAD65基因，基因進行3次測序拼接序列與Gen-Bank中的序列幾乎一致(1 818/1 823)，符合率達到99.72％。只有5個堿基與原堿基不同，但并沒有引起氨基酸序列的改變，也沒有造成錯義突變，說明應用RT-PCR方法成功克隆出了rGAD65基因。

2.2rGAD65基因siRNA的設計、構建根據(jù)rGAD65的基因序列，設計了三條小干擾序列(siRNAn-rGAD65)，同時設計一條無關序列Negative(siRNAneg-rGAD65)用于對照組實驗，通過BLAST驗證該序列對于任何基因無干擾效果，設計引物和酶切位點，克隆并測序，貯存序列正確的克隆產(chǎn)物。3個實驗序列依次是:序列1: 3＇-GCATTGGTTGACATCAACACTCTCTTGAATTCTGTTGATGTCAACCAATCTGCTTTTTT-5＇;序列2: 3＇-GCATTTCTGCAAGATGTAATGCTCTCTTGAATTCCATTACATCTTGCAGAAATGCTTTTTT-5＇;序列3: 3＇-GCAGCAGATTGGTTGACATCACTCTCTTGAATTCTGATGTCAACCAATCTGCTGCTTTTTT-5＇。首先小量逆轉錄病毒病毒包裝，用rGAD65預先感染293細胞，再用siRNA感染293細胞，可見紅色熒光明顯減少，經(jīng)Real time PCR的結果顯示，序列3干擾序列干擾效率可達66％。見圖1。

圖1　GAD65基因感染HEK293細胞后，再次應用siRNA-GAD65(negative)感染293細胞

2.3siRNA的大量包裝及滴度檢測按慢病毒包裝試劑盒的說明書將各種包裝質粒按一定的比例混合，共轉染包裝細胞293T，2 d后收集上清和細胞，獲得重組病毒載體LV-GFP-siRNA3-GAD65。并經(jīng)冷凍干燥濃縮收集到的病毒。經(jīng)滴度測定，病毒的滴度為4.8×108/ml。分裝，－80℃冷凍保存?zhèn)溆谩?/p>

2.4LV-GFP-siRNA3-GAD65的功能檢測

2.4.1體外檢測轉染LV-GFP-siRNA3-GAD65的細胞的GAD65的表達明顯低于陰性對照組(轉染LV-GFP-siRNAneg-GAD65)和正常細胞組，但對照組和正常細胞組則沒有明顯的區(qū)別(圖2)。

圖2　GAD65在大腦皮質中的表達

2.4.2體內檢測注射LV-GFP-siRNA3-GAD65的蒼白球內側部中GAD65蛋白表達明顯低于無關對照(LV-GFP-siRNA3neg-GAD65)、PBS和正常的腦組織，且無關對照、PBS組及正常腦組織三者間沒有明顯的差異。見圖3。

圖3　GAD65在蒼白球內側部的表達

3　討論

GAD65主要分布于神經(jīng)元軸突及以細胞膜結合酶的形式存在〔3〕，STN定點注射GAD65能減弱PD模型動物行為異常和保護黑質DA神經(jīng)〔4〕，可推測GAD65產(chǎn)生的GABA起到傳統(tǒng)觀念的神經(jīng)遞質的作用〔5〕，所以本實驗所選用的研究對象為GAD65。如果能在體內抑制或下調GAD65的功能，則可能會減少GABA能神經(jīng)元在興奮過程中釋放GABA的量，達到緩解PD運動癥狀的作用。

短小干擾雙鏈RNA(siRNA)能降解具有與其序列相同的單鏈mRNA分子，從而高效、特異地沉默靶基因的表達〔6〕，在細胞內發(fā)揮基因敲除的作用〔7〕。受此啟發(fā)，應用RNAi技術沉默GPi和SNr的GAD基因的表達，減少GPi和SNr神經(jīng)末稍釋放GABA的量，可能會重新建立一種大腦基底神經(jīng)環(huán)路的平衡。本實驗將克隆所得的GAD65 cDNA的CDS全長亞克隆入慢病毒中，酶切鑒定正確。應用siRNA的設計軟件設計并合成了siRNA，經(jīng)篩選后獲得了針對rGAD65高效特異的小干擾RNA。并且體內和體外均驗證了小干擾RNA的功能，能沉默rGAD65基因，下調了大鼠GAD65蛋白的表達，說明針對rGAD65的siRNA已經(jīng)設計、構建并包裝成功，可以用于后續(xù)的體內實驗。

4　參考文獻

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〔2013-07-18修回〕

(編輯趙慧玲/曹夢園)

通訊作者:鄭德宇(1973-)，男，博士，教授，主要從事神經(jīng)退行性病變的研究。

〔中圖分類號〕R742.5

〔文獻標識碼〕A

〔文章編號〕1005-9202(2015) 16-4465-03;

doi:10.3969/j.issn.1005-9202.2015.16.020