劉亦恒　張　壽　朱振標(biāo)　沈　慧　吳多慶　丁曉莉(?？谑腥嗣襻t(yī)院骨科中心，海南　?？凇?70208)

巴戟天多糖對(duì)去卵巢大鼠核因子-κB受體激活因子配體和骨保護(hù)素表達(dá)的影響

劉亦恒張壽朱振標(biāo)沈慧吳多慶丁曉莉
(海口市人民醫(yī)院骨科中心，海南?？?70208)

〔摘要〕目的觀察巴戟天多糖對(duì)去卵巢大鼠骨組織核因子-κB受體激活因子配體(RANKL)和骨保護(hù)素(OPG) mRNA表達(dá)的影響。方法

成年雌性SD大鼠30只，隨機(jī)分為假手術(shù)組、模型組、巴戟天多糖組，采用摘取雙側(cè)卵巢法建立骨質(zhì)疏松模型，造模2 w后開始給藥，給藥3個(gè)月后觀察各組大鼠骨密度(BMD)，骨鈣、骨磷含量，RANKL、OPG mRNA的表達(dá)水平。結(jié)果給藥3個(gè)月后巴戟天多糖組能顯著提高去卵巢大鼠的BMD和骨鈣、磷的含量，上調(diào)OPG mRNA表達(dá)，下調(diào)RANKL mRNA表達(dá)，使RANKL/OPG值下降。結(jié)論巴戟天多糖對(duì)去卵巢所致的大鼠骨質(zhì)疏松具有良好的防治作用，其機(jī)制可能與調(diào)控RANKL和OPG mRNA的表達(dá)，降低RANKL/OPG值有關(guān)。

〔關(guān)鍵詞〕絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松;巴戟天多糖;核因子-κB受體激活因子配體;骨保護(hù)素

第一作者:劉亦恒(1976-)，男，博士，副主任醫(yī)師，主要從事骨質(zhì)疏松、脊柱脊髓損傷研究。

絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松(PMOP)是指絕經(jīng)后婦女由于體內(nèi)卵巢功能降低、雌激素水平下降、骨耦聯(lián)過程失調(diào)、破骨細(xì)胞的骨吸收作用大于成骨細(xì)胞的骨形成所導(dǎo)致的骨量減少，骨脆性增加，進(jìn)而易于發(fā)生骨折的代謝性骨疾病。前期實(shí)驗(yàn)表明，巴戟天多糖能促進(jìn)成骨細(xì)胞的增殖能力和堿性磷酸酶(ALP)的活性，影響骨代謝〔1〕。本實(shí)驗(yàn)觀察巴戟天多糖對(duì)雌性去卵巢大鼠骨密度(BMD)，骨鈣、骨磷含量，核因子-κB受體激活因子配體(RANKL)和骨保護(hù)素(OPG) mRNA表達(dá)的影響。

1　材料與方法

1.1材料與儀器健康雌性SD大鼠30只，3月齡，體重(270±10) g，購自海南醫(yī)學(xué)院;巴戟天藥材產(chǎn)于海南萬寧; TRIzol Reagent，美國Invitrogen公司; RT及Real Time PCR試劑盒，大連生物工程有限公司; DPX-L型雙能X射線骨密度儀(美國Lunar公司) ;實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀7500型(美國ABI公司) ;酶標(biāo)儀(北京六一儀器)等。

1.2方法

1.2.1巴戟天多糖的制備取200 g巴戟天干制品粉碎，烘干，過40目篩，加入10倍體積的水，煮沸1 h，濾過，再加入3倍體積的乙醇，靜置12 h，收集沉淀，得巴戟天燥粗多糖;粗多糖加水復(fù)溶，用Sevag法脫蛋白(重復(fù)2次)，活性炭脫色，無水乙醇、丙酮、乙醚洗滌，濾過。用蒸餾水溶解沉淀物，用無水乙醇加至其濃度為85％，離心收集沉淀物，得巴戟天多糖純品。由海南醫(yī)學(xué)院藥學(xué)系制備鑒定。

1.2.2去卵巢大鼠模型制備隨機(jī)取20只大鼠，用2％戊巴比妥鈉40 mg/kg腹腔麻醉，取背側(cè)雙切口。于脊柱外側(cè)2 cm，髂前上棘上方1.5 cm，備皮去毛，消毒后切開局部皮膚、肌肉和腹膜，輕輕將脂肪團(tuán)拉開并分離，暴露卵巢，結(jié)扎卵巢下端輸卵管，摘除卵巢，縫合切口。另10只大鼠只做手術(shù)切口，不去除卵巢。

1.2.3實(shí)驗(yàn)分組30只雌性SD大鼠分為模型組(生理鹽水+去卵巢)，假手術(shù)組(生理鹽水+假手術(shù))，巴戟天多糖組(去卵巢+100 mg/kg巴戟天多糖)。術(shù)后2 w開始，巴戟天多糖組予灌胃給藥，假手術(shù)組和模型組給予等體積的生理鹽水，共12 w。

1.2.4BMD及骨鈣、骨磷測(cè)定于術(shù)后3個(gè)月，在麻醉狀態(tài)下對(duì)各組大鼠用雙能X射線骨密度儀的小動(dòng)物測(cè)量軟件測(cè)定右股骨頸的骨密度(BMD)。BMD測(cè)定后收集大鼠右側(cè)股骨，馬福爐800℃灰化，灰化后標(biāo)本測(cè)定骨中鈣、磷的百分含量。

1.2.5實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)應(yīng)用Real time-PCR儀檢測(cè)實(shí)驗(yàn)大鼠第三腰椎骨組織中RANKL和OPG mRNA表達(dá)。

1.2.5.1骨組織總RNA的提取術(shù)后3個(gè)月，取大鼠第三腰椎，剔除周圍軟組織，0.9％鹽水沖洗，吸干水分，放入液氮中30 min，再取出置室溫下5 min，重復(fù)凍融三次。加液氮在研缽中，研碎骨組織，按TRIzol試劑說明書提取總RNA，用DEPC處理水溶解。分光光度計(jì)260/280測(cè)定RNA樣品濃度并進(jìn)行質(zhì)量鑒定，瓊脂糖凝膠電泳證實(shí)總RNA的完整性。

1.2.5.2 cDNA第一鏈的合成取2 μg總RNA，按RT-PCR試劑盒操作手冊(cè)進(jìn)行操作，合成cDNA，置－70℃保存。

1.2.5.3實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)根據(jù)目的基因在Genbank中的已知序列，由生工生物工程有限公司設(shè)計(jì)、合成。引物序列如下，GAPDH:上游5'-TGA ACG GGA AGC TCA CTG G-3'，下游5'-TCC ACC ACC CTG TTGCTG TA-3'; OPG:上游5'-CAT CGA AAG CAC CCT GTA-3'，下游5'-CAC TCA GCC AAT TCG GTA T-3'; RANKL:上游5'-CGT ACC TGC GGA CTATCT TCA-3'，下游5'-GTT GGA CAC CTG GACGCT AA-3'。按熒光定量PCR儀操作手冊(cè)添加樣本，三步法進(jìn)行PCR反應(yīng)。擴(kuò)增條件: 95℃預(yù)變性5 min ;然后95℃變性15 s，58℃退火20 s，72℃延伸35 s，共循環(huán)40次。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SPSS15.0軟件進(jìn)行t檢驗(yàn)。

2　結(jié)果

2.1巴戟天多糖對(duì)去卵巢大鼠BMD及骨鈣、磷的影響與假手術(shù)組比較，模型組BMD和骨鈣、磷含量均降低(P＜0.05) ;與模型組比較，巴戟天多糖組BMD和骨鈣、磷含量均升高(P＜0.05)。見表1。

2.2巴戟天多糖對(duì)去卵巢大鼠RANKL和OPG mRNA表達(dá)的影響與假手術(shù)組比較，模型組大鼠RANKL mRNA表達(dá)水平增高，OPG mRNA表達(dá)水平降低，RANKL/OPG值增高(P＜0.01) ;與模型組比較，巴戟天多糖組RANKL mRNA表達(dá)降低，OPG mRNA表達(dá)增高，RANKL/OPG值降低(P＜0.05)。見表2。

表1　巴戟天多糖對(duì)去卵巢大鼠BMD及骨鈣、磷的影響(±s，n=10)

表1　巴戟天多糖對(duì)去卵巢大鼠BMD及骨鈣、磷的影響(±s，n=10)

與假手術(shù)組比較: 1) P＜0.01，2) P＜0.05;與模型組比較: 3) P＜0.05，4) P＜0.01

組別　BMD(g/cm2)　　骨鈣(％)　　骨磷(％)模型組　0.158±0.0151)　61.47±2.862)　27.64±1.212)假手術(shù)組　0.227±0.024　 64.98±1.35　 29.74±1.47巴戟天多糖組　0.219±0.0124)　64.19±1.263)　29.37±1.853)

表2　巴戟天多糖對(duì)去卵巢大鼠RANKL、OPG mRNA表達(dá)及RANKL/OPG比值的影響(±s，n=10)

表2　巴戟天多糖對(duì)去卵巢大鼠RANKL、OPG mRNA表達(dá)及RANKL/OPG比值的影響(±s，n=10)

與假手術(shù)組比較: 1) P＜0.01;與模型組比較: 2) P＜0.05，3) P＜0.01

組別　RANKL　OPG　RANKL/OPG模型組　6.832±2.1441)　0.214±0.0511)　33.282±10.2921)假手術(shù)組　1.147±0.372　 1.258±0.254　 0.926±0.215巴戟天多糖組　4.413±1.2522)　0.765±0.1723)　5.215±1.4873)

3　討論

絕經(jīng)后婦女因雌激素水平急劇下降，從而導(dǎo)致骨代謝平衡破壞，骨量在數(shù)年內(nèi)迅速丟失。據(jù)調(diào)查，PMOP患病率達(dá)18％～25％，主要表現(xiàn)為腰背部疼痛，身高逐漸縮短，甚至輕微的外力作用就可能發(fā)生骨折〔2，3〕。因此，如何預(yù)防PMOP一直是相關(guān)領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)。巴戟天是我國四大南藥之一，具有補(bǔ)腎陽、強(qiáng)筋骨、祛風(fēng)濕的功效。現(xiàn)代研究證明，巴戟天含有多種化學(xué)成分，如蒽醌類、多糖類、氨基酸、烯醚萜及其苷類等，多糖類在巴戟天含量占20％左右〔4，5〕。近年來，有研究表明巴戟天能增加去卵巢小鼠子宮重量及血清雌二醇含量，具有雌激素樣作用〔6〕。進(jìn)一步的研究發(fā)現(xiàn)巴戟天多糖可以刺激體外培養(yǎng)的骨髓基質(zhì)細(xì)胞及成骨細(xì)胞(0B)增殖〔7〕，這預(yù)示著巴戟天用于防治骨質(zhì)疏松(OP)具有重要的研究意義。

BMD值是反映OP程度，預(yù)測(cè)骨折危險(xiǎn)性的重要依據(jù)，也是診斷OP的重要指標(biāo)。OP總是伴隨骨總量的丟失，即是鈣、磷的喪失，因此應(yīng)用骨鈣、骨磷含量的變化評(píng)價(jià)OP藥物治療的有效性已得到了廣泛的認(rèn)同。本文結(jié)果說明巴戟天多糖有促進(jìn)大鼠骨礦物含量增加，提高BMD的作用。

目前對(duì)骨代謝研究發(fā)現(xiàn)，存在于破骨細(xì)胞前體細(xì)胞膜表面的核因子-κB受體激活因子(RANK)是前體細(xì)胞被激活和分化成破骨細(xì)胞最重要的信號(hào)通道，而成骨細(xì)胞分泌的RANKL激活該通道。同時(shí)，成骨細(xì)胞也分泌RANKL的可溶性餌受體OPG，從而與RANKL競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合并阻斷其與RANK的結(jié)合，起到抑制破骨細(xì)胞生成和活化作用〔8，9〕。本實(shí)驗(yàn)表明，巴戟天多糖能通過夠降低RANKL mRNA的表達(dá)，提高OPG mRNA的表達(dá)，達(dá)到抑制破骨細(xì)胞的激活和分化作用。綜上，巴戟天多糖可以增加去卵巢大鼠骨礦物質(zhì)含量，提高BMD;通過調(diào)節(jié)RANKL和OPG mRNA的表達(dá)，降低RANKL/OPG值，達(dá)到抑制破骨細(xì)胞的目的，起到防治去卵巢大鼠所致OP的作用。

4　參考文獻(xiàn)

1崔可賾，劉亦恒，張壽，等.巴戟天多糖含藥血清對(duì)體外成骨細(xì)胞DKK-1表達(dá)的影響〔J〕．時(shí)珍國醫(yī)國藥，2012; 23(4) : 871-2.

2張亞軍，劉忠厚，張鵬.絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥流行病學(xué)研究進(jìn)展〔J〕．中國骨質(zhì)疏松雜志，2010; 16(3) : 229-34.

3de Oliveira Ferreira N，da Silva RB，Arthuso M，et al.Prevalence of vertebral fractures and quality of life in a sample of postmenopausal Brazilian women with osteoporosis〔J〕．Arch Osteoporosis，2012; 7(1) : 101-6.

4梁麗敏，徐勇.南藥巴戟天多糖的研究進(jìn)展〔J〕．食品工業(yè)科技，2011; 32(8) : 478-80.

5張海龍，張慶文，張曉琦，等．南藥巴戟天的代學(xué)成分〔J〕．中國天然藥物，2010; 8(3) : 192-5．

6王寅，張巧艷.巴戟天雌激素樣作用的實(shí)驗(yàn)研究〔J〕．時(shí)珍國醫(yī)國藥，2011; 22(3) : 527-8.

7李楠，王和鳴，郭素華，等.巴戟天多糖及其水提物對(duì)體外培養(yǎng)成骨細(xì)胞活性的影響〔J〕．中國組織工程研究與臨床康復(fù)，2007; 11 (23) : 4570-2.

8 Anastasilakis AD，Toulis KA，Polyzos SA，et al.RANKL inhibition for the management of patients with benign metabolic bone disorders〔J〕．Exp Opin Invest Drugs，2009; 18(8) : 1085-102.

9 Wittrant Y，Theoleyre S，Couillaud S，et al.Relevance of an in vitro osteoclastogenesis system to study receptor activator of NF-κB ligand and osteoprotegerin biological activities〔J〕．Exp Cell Res，2004;293(2) :292-304．

〔2014-08-17修回〕

(編輯安冉冉/曹夢(mèng)園)

基金項(xiàng)目:海南省自然科學(xué)基金(No.811156) ;海南省衛(wèi)生廳資助項(xiàng)目(No.瓊衛(wèi)2010-69) ;海口市重點(diǎn)科技項(xiàng)目(No.2011-0135)

〔中圖分類號(hào)〕R274.9

〔文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼〕A

〔文章編號(hào)〕1005-9202(2015) 16-4456-02;

doi:10.3969/j.issn.1005-9202.2015.16.016