高海寧　王艷杰　趙丹玉　崔　勇　柳　春(遼寧中醫(yī)藥大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，遼寧　沈陽　0032)

六味地黃丸抑制H2O2誘導(dǎo)的PC-12細(xì)胞凋亡的作用機制

高海寧1王艷杰趙丹玉崔勇柳春
(遼寧中醫(yī)藥大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，遼寧沈陽110032)

〔摘要〕目的探討經(jīng)典名方六味地黃丸對H2O2所致PC12細(xì)胞凋亡時bax、caspase-8和bcl-2基因和蛋白表達的調(diào)控作用。方法把大鼠腎上腺嗜鉻瘤(PC-12)細(xì)胞分為4組:對照組、模型組、六味地黃丸組、維生素(Vit) E組。待細(xì)胞培養(yǎng)24 h貼壁后吸去培養(yǎng)液，對照組和模型組都加入含10％大鼠血清培養(yǎng)液，六味地黃丸組和VitE組分別加入含10％六味地黃丸大鼠血清培養(yǎng)液和含VitE的培養(yǎng)液，預(yù)保護24 h后，除對照組之外的各組加入H2O2終濃度為200 μmol/L，對照組加入等量的培養(yǎng)液，繼續(xù)孵育24 h后離心收集細(xì)胞，提取總RNA和蛋白。應(yīng)用RT-PCR和Western印跡方法分別測定bax、caspase-8、bcl-2基因和蛋白質(zhì)表達的變化。結(jié)果六味地黃丸能下調(diào)bax、caspase-3基因和蛋白的表達，對bcl-2基因和蛋白表達有上調(diào)作用。結(jié)論六味地黃丸能通過有效降低bax、caspase-8基因和蛋白表達，提高bcl-2的表達，抑制、阻止PC-12細(xì)胞凋亡，促進細(xì)胞存活。

〔關(guān)鍵詞〕六味地黃丸; PC-12;細(xì)胞凋亡

1沈陽體育學(xué)院運動人體科學(xué)學(xué)院

第一作者:高海寧(1979-)，女，副教授，在讀博士，主要從事運動生理學(xué)研究。

神經(jīng)元變性丟失、大量老年斑(SP)及神經(jīng)纖維纏結(jié)(NFT)形成是阿爾茨海默病(AD) AD的主要病理改變，同時伴有彌漫性大腦皮層萎縮〔1，2〕。細(xì)胞凋亡在AD患者神經(jīng)元的丟失中扮演重要角色，與AD的發(fā)生、發(fā)展關(guān)系密切〔1，2〕。神經(jīng)細(xì)胞損傷是不可復(fù)原的，越來越多的證據(jù)認(rèn)為，氧化應(yīng)激是導(dǎo)致神經(jīng)元凋亡和壞死的重要原因〔3，4〕。H2O2是活性氧簇(ROS)的一種重要形式，作為機體正常有氧代謝的產(chǎn)物，在濃度過高時產(chǎn)生氧化應(yīng)激，引起組織和細(xì)胞的損傷。H2O2通過幾種不同的分子機制誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。本研究通過H2O2誘導(dǎo)PC-12細(xì)胞凋亡，從分子學(xué)水平探討六味地黃丸對改善AD發(fā)生的作用機制。

1　材料與方法

1.1實驗材料大鼠腎上腺嗜鉻瘤(PC12)細(xì)胞，高分化，購于中國科學(xué)院上海生命科學(xué)研究所生化與細(xì)胞所; H2O2(35％ W/W水溶液)，購于阿法埃莎(天津)化學(xué)有限公司; DMEM高糖培養(yǎng)基、雙抗、胰酶，購于Hyclone公司; TaKaRa RNA PCR試劑盒(AMV) Ver.3.0及bax、caspase-3、bcl-2引物購于TaKaRa大連寶生物公司; BCA蛋白質(zhì)測定試劑盒購于碧云天生物科技研究所; DAB顯色試劑盒購于武漢博士德生物工程有限公司。1.2實驗儀器水套二氧化碳培養(yǎng)箱(Thermo Scientific Forma SeriesⅡ，美國) ;生物安全柜(HFsafe-1200，上海力申科技有限公司) ;酶標(biāo)儀(美國BIO-RAD iMark) ;凝膠成像分析儀(WD-9413B，北京市六一儀器廠) ;梯度PCR儀(MycyclerTM Thermal Cycle，美國BIO-RAD) ;高速臺式冷凍離心機(TGL-20M，長沙湘儀離心機儀器有限公司)。

1.3六味地黃丸含藥血清制備大鼠按體重隨機分為對照組和六味地黃丸組，生藥質(zhì)量濃度為0.75 kg/L，水溶液按10 ml/kg六味地黃丸水溶液灌胃，每天2次，空白組給予同體積雙蒸水灌胃，連續(xù)給藥7 d，第7天首次給藥1.5 h后腹主動脈取血，靜置2 h，2 000 r/min離心10 min后分離血清。經(jīng)56℃，30 min滅活，0.22 μm濾膜過濾滅菌，－20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4細(xì)胞的培養(yǎng)PC12細(xì)胞用DMEM高糖培養(yǎng)基接種于細(xì)胞培養(yǎng)瓶中。在37℃，5％CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，根據(jù)細(xì)胞生長的情況，2～3 d按照1∶3的比例傳代一次，采用對數(shù)生長期的細(xì)胞進行實驗。

1.5實驗分組及步驟含藥血清濃度10％為最佳濃度，含藥血清作用預(yù)保護24 h。因此，將細(xì)胞按5×105/ml密度接種于培養(yǎng)瓶內(nèi)，每瓶加培養(yǎng)基3 ml，取對數(shù)生長期的PC12細(xì)胞計數(shù)分四組，37℃，5％CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)孵育24 h貼壁后，對照組的培養(yǎng)基換為含有10％濃度蒸餾水灌胃雄性大鼠血清預(yù)保護24 h;模型組培養(yǎng)基同樣換成含有10％濃度蒸餾水灌胃雄性大鼠血清預(yù)保護24 h后加入H2O2終濃度為200 μmol/L;六味地黃丸組培養(yǎng)基換為含有10％濃度六味地黃丸灌胃雄性大鼠血清預(yù)保護24 h后加入H2O2終濃度為200 μmol/L; VitE組培養(yǎng)基換為含有20 μmol/L VitE和10％濃度蒸餾水灌胃雄性大鼠血清預(yù)保護24 h后加入H2O2終濃度為200 μmol/L。24 h后提取各組總RNA和蛋白，深溫冰箱保存待檢。

1.6RT-PCR檢測Bax mRNA、caspase-8 mRNA和bcl-2 mRNA各組細(xì)胞加藥處理結(jié)束后，提取細(xì)胞總RNA，分別測定并計算A260 nm/280 nm值及其比值，以鑒定純度。隨后用RT-PCR試劑盒進行逆轉(zhuǎn)錄及聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)。引物由TaKaRa大連寶生物公司合成。β-actin引物序列:上游引物: 5'-AGCCATGTACGTAGCCATCC-3';下游引物: 5'-CTCTCAGCTGTGGTGGTGAA-3'，PCR產(chǎn)物序列長度為592 bp。bcl-2引物序列:上游: 5'-GCTACGAGTGGGATACTGGAGA-3';下游: 5'-AGTCATCCACAGAGC GATGTT-3'，擴增產(chǎn)物的DNA全長為446 bp。bax引物序列:上游: 5'-CATCTCCTTCATCCTTGCTG-3';下游: 5'-CCAGCC ACAAAGATGGTCACT-3'，擴增產(chǎn)物的DNA全長為337 bp。caspase-8引物序列:上游: 5'-CCCGTGAAGCAAGGATTT-3';下游: 5'-ACTGTGGGTCTGGGAAGC-3'，擴增產(chǎn)物的DNA全長為488 bp。反應(yīng)參數(shù):熱啟動94℃預(yù)變性2 min; 94℃變性30 s，65℃退火30 s，72℃延伸1 min，共30個循環(huán)。72℃延伸5 min。瓊脂糖凝膠電泳，WD-9413B凝膠成像分析儀進行拍照、圖像分析。

1.7Western印跡檢測Bax、caspase-8和bcl-2的蛋白表達收集各組細(xì)胞用細(xì)胞裂解液裂解，12 000 r/min，4℃離心10 min，用BCA試劑進行蛋白定量。以四組中提取蛋白濃度最小組為基礎(chǔ)，其余三組蛋白稀釋，使四組蛋白濃度一致后，取各組蛋白樣品各100 μl，加入5×上樣緩沖液25 μl，100℃煮5 min，冷卻后，每泳道上樣量30 μl，10％SDS-PAGE電泳后將蛋白轉(zhuǎn)移至聚偏二氟乙烯(PVDF)膜上。用含5％脫脂牛奶的TBST 37℃下封閉2 h，1∶1 000加入Bax、caspase-8、bcl-2及β-actin的一抗于4℃過夜，TBST快洗膜3次，慢洗3次，每次5 min，加入相應(yīng)的二抗37℃孵育2 h后，TBST快洗膜3次，慢洗3次，每次5 min，使用DAB顯色劑顯色，結(jié)果用圖像分析儀分析，以面積和光密度的乘積為積分光密度表示。

1.8統(tǒng)計學(xué)方法應(yīng)用SPSS10.0統(tǒng)計軟件進行one-way ANOVA分析。

2　結(jié)果

與對照組相比，模型組H2O2作用24 h后，bax和caspase-8 mRNA和蛋白平均光密度值顯著升高，即其含量顯著升高(P＜0.01)，而六味地黃丸組和VitE組預(yù)保護24 h之后，與模型組相比bax和caspase-8 mRNA和蛋白平均光密度值均有顯著降低(P＜0.01，P＜0.05)。與對照組相比，模型組H2O2作用24 h后，bcl-2 mRNA和蛋白平均光密度值顯著降低，即其含量顯著降低(P＜0.01)，而六味地黃丸組和VitE組預(yù)保護24 h之后，與模型組相比bcl-2 mRNA和蛋白平均光密度值均有顯著升高(P＜0.01)。見表1、表2和圖1、圖2。

表1　各組PC-12細(xì)胞中bax、caspase-8及bcl-2 mRNA及β-actin mRNA表達(±s，n=6)

表1　各組PC-12細(xì)胞中bax、caspase-8及bcl-2 mRNA及β-actin mRNA表達(±s，n=6)

與對照組比較: 1) P＜0.01;與模型組比較: 2) P＜0.05，3) P＜0.01

組別　bax/β-actin　 caspase-8/β-actin　 bcl-2/β-actin對照組　0.262±0.048　 0.293±0.061　 0.427±0.035模型組　0.448±0.0321)　0.478±0.0411)　0.254±0.0741)六味地黃丸組　0.351±0.0343)　0.367±0.0543)　0.333±0.0822)VitE組　0.346±0.0123)　0.394±0.0822)　0.309±0.0452)

圖1　各組PC-12細(xì)胞中bax mRNA、caspase-8 mRNA、bcl-2 mRNA及β-actin mRNA表達

表2　各組PC-12細(xì)胞中bax、caspase-8、bcl-2及β-actin蛋白表達(±s，n=4)

表2　各組PC-12細(xì)胞中bax、caspase-8、bcl-2及β-actin蛋白表達(±s，n=4)

與對照組比較: 1) P＜0.01;與模型組比較: 2) P＜0.05，3) P＜0.01

組別　bax/β-actin　 caspase-8/β-actin　 bcl-2/β-actin對照組　0.242 7±0.003 5 0.161 8±0.020 7 0.108 4±0.009 6模型組　0.124 8±0.012 71)0.085 1±0.009 11)0.165 9±0.014 71)六味地黃丸組0.201 4±0.015 93)0.147 1±0.024 13)0.120 8±0.020 13)VitE組　0.198 9±0.020 73)0.148 3±0.016 03)0.134 4±0.008 62)

圖2　各組PC-12細(xì)胞中bax、caspase-8、bcl-2及β-actin蛋白的表達

3　討論

六味地黃丸的記載始見于宋代名醫(yī)、兒科專家錢乙的《小兒藥證直訣》，用來治療小兒先天不足、發(fā)育遲緩等病癥，是滋陰補腎的傳統(tǒng)基礎(chǔ)方劑。組成:熟地黃24 g，山萸肉、淮山藥各12 g，澤瀉、茯苓、丹皮各9 g。Bax和bcl-2都屬于bcl基因家族，Bax能誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡而促進細(xì)胞死亡，bcl-2阻斷細(xì)胞凋亡而促進細(xì)胞存活。Bax與bcl-2功能相反，bcl-2和Bax的表達強度決定細(xì)胞命運〔5〕。神經(jīng)細(xì)胞是一種已停止分化并長期存活的細(xì)胞，其損傷是不可復(fù)原的。PC-12細(xì)胞在H2O2誘導(dǎo)下，細(xì)胞內(nèi)Bax占優(yōu)勢，促進細(xì)胞凋亡的發(fā)生發(fā)展。本文說明六味地黃丸和VitE通過阻止bax的表達來誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡而促進細(xì)胞死亡，并促進bcl-2的表達來阻斷細(xì)胞凋亡而促進細(xì)胞存活，從而減少H2O2誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡。

另外大量研究顯示，細(xì)胞凋亡過程與caspase底物的切割密切相關(guān)〔6〕。caspase家族中有6種被認(rèn)為肯定參與了細(xì)胞凋亡的過程，即caspase-3、-6、-7、-8、-9和-10。通常caspase-8介導(dǎo)死亡受體通路的細(xì)胞凋亡。有報道caspase-8能切割bcl家族成員從而激活一系列連鎖反應(yīng)，最終促進caspase-3活化，發(fā)揮促凋亡作用。本文說明PC-12細(xì)胞內(nèi)caspase-8含量降低，從而減少H2O2誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡。

AD的病因在于腎中精氣不足，現(xiàn)代研究表明六味地黃丸主治“腎怯，神不足”，具有抗衰老及抗氧化作用，對于老年癡呆、神經(jīng)衰弱及健忘均有良好療效。六味地黃丸改善AD發(fā)生是通過有效降低Bax、caspase-8基因和蛋白表達，提高bcl-2的表達，從而抑制氧化應(yīng)激導(dǎo)致的神經(jīng)元凋亡和壞死，起到延緩衰老的作用。

4　參考文獻

1張均田.老年癡呆的發(fā)病機制及治療策略〔M〕．北京:人民衛(wèi)生出版社，2002: 16-29.

2 Smitha MA，Zhua XW，Tabatonb M，et al.Increased iron and free radical generation in preclinical alzheimer disease and mild cognitive impairment 〔J〕．J Alzh Dis，2010; 19(1) : 363-72.

3率紅莉.阿爾茨海默病臨床藥物研究綜述〔J〕．中國藥師，2013; 12 (8) : 1139-41.

4李玲玲，劉蓉，葉蘭，等.抗氧化劑在阿爾茨海默病治療中的地位和臨床應(yīng)用前景〔J〕．國際神經(jīng)病學(xué)神經(jīng)外科學(xué)雜志，2009; 36(6) : 270-4.

5王彤，劉存志，劉玉珍，等.Bcl-2/bax基因調(diào)控機體細(xì)胞凋亡的機制研究進展〔J〕．中國老年學(xué)雜志，2008; 28(16) : 1658-60.

6 Zhu YS，Chen Q.Mitochondria and apoptosis regulation〔J〕．Chin Bull Life Sci，2008; 4(20) : 506-13.

〔2014-03-21修回〕

(編輯苑云杰)

通訊作者:柳春(1963-)，女，教授，博士，博士生導(dǎo)師，主要從事中醫(yī)藥對臟腑功能調(diào)控作用的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)機制研究。

基金項目:遼寧省科學(xué)技術(shù)規(guī)劃項目(No．2012225018) ;沈陽體育學(xué)院重點學(xué)科建設(shè)項目(XKFX1511)

〔中圖分類號〕R365

〔文獻標(biāo)識碼〕A

〔文章編號〕1005-9202(2015) 16-4437-03;

doi:10.3969/j.issn.1005-9202.2015.16.008