韓 坤，王丹萍，袁 磊△

（1.漯河醫(yī)學高等?？茖W校分子生物實驗室，河南漯河462000；2.河南省漯河市中心醫(yī)院內(nèi)分泌科 462000）

胡蘆巴堿（trigonelline，TRG）是一種生物堿，最早是從豆科植物葫蘆巴的干燥種子中提取出來的，故而得名，此后發(fā)現(xiàn)TRG 還廣泛存在于各種豆科植物的種子和咖啡中［1］。同時，TRG 還是人體內(nèi)煙酸和色氨酸的代謝產(chǎn)物［2］。TRG具多種生物學作用，如降低血糖血脂［3-4］、抑癌［5］、抗氧化［6］、改善記憶［7］和抗感染［8］等。最近的一項研究表明，TRG 具有心肌保護作用［9］。本研究通過建立乳鼠心肌細胞缺氧／復氧模型，觀察胡蘆巴堿對缺氧／復氧心肌細胞的凋亡、超氧化物歧化物（SOD）和丙二醛（MDA）水平、線粒體膜電位以及caspase-9和caspase-3活性的影響，以探究TRG 對缺氧／復氧心肌細胞的保護作用及其機制，為治療心肌缺血再灌注損傷提供新思路。

1 材料與方法

1.1 材料 出生72h內(nèi)的SD 乳鼠購自鄭州大學實驗動物中心，高糖DMEM 和胎牛血清（Hyclone公司），TRG、典化丙啶（PI）、Rhodamine123、procaspase-9 抗體、cleaved caspase-9、procaspase-3抗體和cleaved caspase-3抗體（Sigma公司），總SOD（TSOD）試劑盒和MDA試劑盒（南京建成生物工程研究所）。

1.2 方法

1.2.1 乳鼠心肌細胞原代培養(yǎng) 將出生3d 以內(nèi)的SD 乳鼠心室肌剪碎，用0.125%胰蛋白酶進行消化，采用差速貼壁法純化心肌細胞，用含20% 胎牛血清的DMEM 培養(yǎng)基，于37℃、5% CO2孵箱中培養(yǎng)，每隔48小時更換一次細胞培養(yǎng)液，待細胞融合度達80%以上時進行實驗。

1.2.2 制備缺氧／復氧心肌細胞損傷模型 將培養(yǎng)的心肌細胞換用預先經(jīng)95%N2和5%CO2混合氣體飽和1h 的缺氧液，于95% N2、5%CO2的密閉容器中培養(yǎng)2h，再換用預先經(jīng)95% O2和5%CO2混合氣體飽和1h的復氧液，于95%O2、5%CO2的密閉容器中培養(yǎng)4h，建立心肌細胞缺氧／復氧損傷模型［8-9］。

1.2.3 實驗分組 正常對照（Control組）：更換正常培養(yǎng)基后于37 ℃、5%CO2孵箱中培養(yǎng)6h；缺氧／復氧組（H／R 組）：更換缺氧液缺氧培養(yǎng)2h，再更換復氧液復氧培養(yǎng)4h；TRG 加缺氧／復氧組（TRG＋H／R 組）：更換含TRG（100nmol／mL）的缺氧液缺氧培養(yǎng)2h，再更換含TRG（100nmol／mL）的復氧液復氧培養(yǎng)4h。

1.2.4 流式細胞術檢測細胞凋亡 制備各實驗組細胞懸液，用PBS洗滌細胞2次，然后用70% 冰乙醇于4 ℃固定24h，再用PBS洗2次，加入1mL PI染液，4℃避光染色30min，送流式細胞儀檢測。

1.2.5 SOD 與MDA 檢 測 SOD 的 測 定 采 用 黃 嘌 呤 氧 化 酶法，MDA 的測定采用硫代巴比妥酸法，按照試劑盒說明書測定。

1.2.6 流式細胞術檢測線粒體膜電位 制備細胞懸液，用PBS緩沖液漂洗2次，將Rhodamine123加入到細胞懸液（終濃度為5μg／mL），37 ℃孵育箱中放置30min，再用PBS緩沖液漂洗2次，送流式細胞儀檢測。

1.2.7 Western blot檢測蛋白水平 裂解各組細胞提取總蛋白，BCA 法測定蛋白濃度，經(jīng)10%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠（SDS-PAGE）電泳并轉(zhuǎn)移至聚偏氟乙烯（PVDF）膜，用封閉液（5%BSA／TBST）封閉1h，加入一抗（1∶1 000稀釋）4℃孵育過夜，TBST 洗膜3次，加入二抗（1∶1 000稀釋）室溫下孵育1h，TBST 洗膜3次，加入ECL 進行發(fā)光反應，暗室X膠片顯影，膠片用凝膠成像系統(tǒng)攜帶的白色光源拍照，β-actin蛋白條帶為內(nèi)參照。

1.3 統(tǒng)計學處理 采用SPSS16.0軟件分析數(shù)據(jù)，計量資料以±s表示，多組間比較采用單因素方差分析（ANOVA），組間兩兩比較采用LSD 法，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結 果

2.1 TRG 對缺氧／復氧心肌細胞凋亡的影響 流式細胞術結果顯示，Control組、H／R 組和TRG＋H／R 組的細胞凋亡率分別為（5.2±0.9）%、（38.7±4.3）%和（24.1±3.6）%，H／R 組較Control組明顯升高（P＜0.05），TRG＋H／R 組較H／R 組明顯降低（P＜0.05）。見圖1。

圖1 TRG 對缺氧／復氧心肌細胞凋亡的影響

2.2 TRG 對缺氧／復氧心肌細胞SOD 活性和MDA 水平的影響 與Control組比較，H／R 組SOD 活性降低、MDA 水平升高（P＜0.05），說明H／R 組細胞抗氧化能力降低。與H／R 組比較，TRG＋H／R 組SOD 活性增強、MDA 水平降低（P＜0.05）。見表1。

2.3 TRG 對缺氧／復氧心肌細胞線粒體膜電位的影響 應用流式細胞儀檢測各實驗組樣本的熒光強度，用平均熒光強度值（mean fluorescence intensity，MFI）代表線粒體膜電位的水平。結果顯示，H／R 組MFI 3 789±221較Control組5 481±319大幅下降（P＜0.05），表明缺氧／復氧刺激使線粒體膜電位發(fā)生了顯著的去極化；TRG＋H／R 組MFI 4 36±257較H／R 組明顯升高（P＜0.05），說明TRG 能夠穩(wěn)定線粒體膜電位。見圖2。

表1 各組SOD 活性和MDA 含量比較（±s）

表1 各組SOD 活性和MDA 含量比較（±s）

a：P＜0.05，與Control組比較；b：P＜0.05，與H／R 組比較。

組別 SOD（U／mgprot） MDA（nmol／mgprot）Control組115.81±10.63 3.13±0.46 H／R 組 54.24±8.71a 9.58±1.02a TRG＋H／R 組 81.66±9.38b 7.23±0.65 b

圖2 TRG 對缺氧／復氧心肌細胞線粒體膜電位的影響

2.4 TRG 對caspase-9 和caspase-3 活性的影響 Western blot結果顯示，H／R 組procaspase-9（p47）和procaspase-3（p32）較Control組明顯減少（P＜0.05），但cleaved caspase-9（p35）和cleaved caspase-3（p17）顯著增多，這表明缺氧／復氧刺激使caspase-9和caspase-3活化。TRG＋H／R 組procaspase-9（p47）和procaspase-3（p32）較H／R 組明顯增多（P＜0.05），cleaved caspase-9（p35）和cleaved caspase-3（p17）顯著減少（P＜0.05），表明TRG 可抑制缺氧／復氧誘導的caspase-9 和caspase-3的活化。見圖3。

圖3 TRG 對caspase-9和caspase-3活性的影響

3 討 論

細胞凋亡在缺血／再灌注損傷過程中發(fā)揮重要作用［10］。心肌缺血／再灌注所導致的心肌細胞凋亡與細胞內(nèi)能量代謝紊亂、線粒體滲透性轉(zhuǎn)換孔的開放、鈣超載、氧自由基的產(chǎn)生與清除失衡等均有關［11-14］。

在本研究中，乳鼠心肌細胞經(jīng)缺氧／復氧后，與Control比較，H／R 組心肌細胞凋亡率明顯升高，說明缺氧／復氧心肌細胞損傷模型建立成功。與H／R 組比較，TRG＋H／R 組心肌細胞凋亡率明顯降低，說明TRG 對缺氧／復氧損傷的心肌細胞具有一定的保護作用。

參與心肌缺血再灌注損傷的自由基主要有羥自由基、過氧化氫和超氧陰離子等。心肌缺血再灌注時，自由基清除系統(tǒng)功能下降，從而產(chǎn)生大量的自由基。自由基可廣泛攻擊含不飽和脂肪酸的生物膜結構，引起脂質(zhì)過氧化，破壞膜結構和功能并產(chǎn)生大量MDA。SOD 是人體最重要的自由基清除劑，當自由基大量增多時SOD 消耗增加，SOD 活性就會下降［15］。因此有效阻止氧自由基產(chǎn)生并增強清除氧自由基的能力成為治療心肌缺血再灌注損傷的重要措施之一。

本研究結果顯示，與Control組比較，H／R 組心肌細胞內(nèi)MDA 水平顯著升高，同時SOD 活性顯著下降，表明缺氧／復氧過程使得脂質(zhì)過氧化反應強烈，細胞損傷嚴重，而TRG 可能通過增強心肌細胞對氧自由基的清除能力，減輕細胞膜脂質(zhì)過氧化損傷，從而發(fā)揮對心肌細胞的保護作用。

缺血再灌注時所產(chǎn)生的鈣超載和氧自由基可促進線粒體通透性轉(zhuǎn)換孔大量開放，導致線粒體膜電位去極化，線粒體高度腫脹，外膜破裂，線粒體膜間隙中的細胞色素C（Cyt C）和凋亡誘導因子（AIF）等凋亡因子被釋放到細胞質(zhì)中，繼而激活caspase-9和caspase-3，最終導致細胞凋亡［16］。線粒體膜電位去極化是線粒體功能逐漸喪失的關鍵階段。

本研究結果顯示，與Control組比較，H／R 組心肌細胞線粒體膜電位發(fā)生了顯著的去極化，procaspase-9和procaspase-明顯減少，但cleaved caspase-9和cleaved caspase-3顯著增多，這表明缺氧／復氧過程使得線粒體通透性轉(zhuǎn)換孔大量開放，caspase-9和caspase-3被激活。與H／R 組比較，TRG＋H／R組心肌細胞線粒體膜電位水平顯著升高，cleaved caspase-9和cleaved caspase-3顯著減少，這表明TRG 對線粒體膜電位水平起到了穩(wěn)定作用，抑制了caspase-9和caspase-3的活化，這可能與其抗氧化能力有關，但其對心肌細胞鈣超載是否起到抑制作用尚待進一步闡明。

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