梁姣姣，居頌文，高志欣

（南京醫(yī)科大學(xué)附屬蘇州醫(yī)院北區(qū)：1．消化系疾病與營養(yǎng)研究中心；2．消化科，蘇州215008）

調(diào)節(jié)性CD4＋CD25＋T（regulatory T，CD4＋CD25＋Treg）細胞是機體重要的負性免疫調(diào)節(jié)成分。Treg細胞約占外周CD4＋細胞的5%～10%，這類細胞數(shù)量雖少但功能強大在機體免疫穩(wěn)態(tài)維持、腫瘤免疫等方面發(fā)揮著重要作用［1－5］。FOXP3在Treg細胞發(fā)育和功能中起關(guān)鍵作用，是CD4＋CD25＋Treg細胞特異性的標(biāo)記［6］。新近研究發(fā)現(xiàn)，健康人外周血T淋巴細胞中CD127和Foxp3的表達呈負相關(guān)，CD127可以識別CD4＋CD25＋Treg細胞與活化的T細胞，因此，根據(jù)細胞表面CD127表達，可將Treg細胞定義CD4＋CD25hiCD127low／－

Treg細胞［7－8］。Treg細胞通過細胞間接觸依賴機制發(fā)揮作用或分泌IL－10和TGF－β1等細胞因子，抑制CD4＋CD25－T細胞、CD8＋T細胞和樹突狀細胞等其他免疫細胞的活性和功能［5］。PD－L1是新發(fā)現(xiàn)的B7家族中的共刺激分子，PD－L1與T細胞表面的相應(yīng)配體PD－1結(jié)合，傳遞負反饋信號，抑制T細胞的激活和效應(yīng)應(yīng)答，腫瘤細胞表達的PD－L1能抑制細胞毒性T淋巴細胞（CTL）的抗腫瘤活性，從而逃避免疫攻擊［9－11］。而 PD－L1在腫瘤患者 CD4＋CD25hiCD127low／－Treg 細胞上的表達及臨床意義目前研究較少，本研究探討了結(jié)腸癌患者外周血中PD－L1在CD4＋CD25hiCD127low／－Treg細胞上的表達及其與腫瘤病理分期及患者荷瘤狀況之間的相關(guān)性。

1 資料與方法

1．1 一般資料 分別采集結(jié)腸癌患者血樣47份，其中男25份，女22份，年齡31～82歲，平均62．5歲，同時采集健康人血樣10份作對照，其中男5份，女5份，年齡26～80歲，平均49．2歲?；颊邩颖緛碜阅暇┽t(yī)科大學(xué)附屬蘇州醫(yī)院北區(qū)和蘇州大學(xué)附屬第二人民醫(yī)院。所有患者樣本在化學(xué)治療、放射治療之前采集。

1．2 方法 采用聚蔗糖－泛影葡胺（Ficoll－Hypaque）密度梯度離心法從肝素全血中分離外周血單個核細胞（peripheral blood mononuclear cells，PBMCs）。各種合適滴度的單克隆抗體與單細胞懸液在4℃條件下孵育染色20min。同時用同型對照的單克隆抗體孵育單細胞懸液，以判斷非特異性染色的程度。然后應(yīng)用FACSCalibur流式細胞儀上機檢測。

1．3 統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS13．0軟件進行數(shù)據(jù)分析，計量資料用x±s表示，組間比較采用t檢驗；計數(shù)資料采用率表示，組間采用χ2檢驗。檢驗水準(zhǔn)α＝0．05，以P＜0．05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2．1 結(jié)腸癌患者外周血中 CD4＋CD25hiCD127low／－Treg細胞上PD－L1的表達 結(jié)腸癌患者以及健康志愿者的PBMCs分別標(biāo)記抗不同的熒光抗體（CD4－FITC單抗、CD25－PECy5單抗、CD127－APC單抗、PD－L1－PE單抗，BD公司）。流式細胞術(shù)分析CD4＋CD25hiCD127low／－Treg細胞的含量及其PD－L1的表達。與健康志愿者比較，結(jié)腸癌患者的CD4＋CD25hiCD127low／－Treg細胞的百分含量明顯增加（P＜0．01），見圖1，且CD4＋CD25hiCD127low／－Treg細胞PD－L1分子的表達明顯上升（P＜0．01），見圖2。進一步的分析表明，PD－L1分子在Ⅲ期和Ⅳ期患者CD4＋CD25hiCD127low／－Treg細胞上的表達明顯高于Ⅰ期和Ⅱ期患者，見圖3。

2．2 CD4＋CD25hiCD127low／－Treg PD－L1的表達與腫瘤患者的荷瘤狀況相關(guān)性 結(jié)腸癌患者手術(shù)前和手術(shù)后3周的PBMCs分別標(biāo)記 CD4－FITC單抗、CD25－PECy5單抗、CD127－APC單抗、PD－L1－PE單抗，流式細胞儀分析 CD4＋CD25hiCD127low／－Treg細胞上PD－L1的表達。研究結(jié)果表明，術(shù)后結(jié)腸癌患者CD4＋CD25hiCD127low／－Treg上PD－L1的表達較術(shù)前明顯下降（P＜0．05），見圖4。

圖1 結(jié)腸癌患者外周血中CD4＋CD25hi CD127low／－Treg細胞含量明顯增加

圖2 PD－L1分子在結(jié)腸癌患者外周血CD4＋CD25hi CD127low／－Treg中表達升高

圖3 PD－L1分子在不同分期結(jié)腸癌患者外周血CD4＋CD25hi CD127low／－Treg細胞中表達變化

圖4 手術(shù)后PD－L1分子在結(jié)腸癌患者外周血CD4＋CD25hi CD127low／－Treg中表達下降

3 討 論

諸多報道表明，Treg細胞的增加是導(dǎo)致腫瘤逃逸的重要因素。例如，在非小細胞肺癌和卵巢癌患者腫瘤浸潤淋巴細胞中Treg的含量明顯增多［12－13］。在胃腸道腫瘤患者中CD4＋CD25－T細胞明顯減少而Treg細胞數(shù)量增多，且Treg細胞數(shù)量的增高與較差的預(yù)后和較低的生存率高度相關(guān)［14］。Treg數(shù)量的增加在頭頸部鱗癌、肝癌、多發(fā)性骨髓瘤等許多腫瘤患者中也均有報道［15－16］。本研究也證實，在結(jié)腸癌患者外周血中CD4＋CD25hiCD127low／－Treg細胞的百分含量明顯增加。進一步的研究表明CD4＋CD25hiCD127low／－Treg細胞上PD－L1表達明顯升高。統(tǒng)計分析結(jié)果表明，晚期患者PD－L1的表達水平明顯高于早期患者。手術(shù)后患者CD4＋CD25hiCD127low／－Treg細胞上PD－L1表達明顯降低。PD－L1分子在Treg細胞上的表達水平與腫瘤分期密切相關(guān)，隨著腫瘤的縮小或切除，PD－L1分子的表達水平會隨之不同程度下降，說明PD－L1表達水平與腫瘤負荷相關(guān)。PD－L1是重要的免疫抑制分子，PDL1與PD－1結(jié)合后抑制T細胞、B細胞、NK細胞功能，從而介導(dǎo)腫瘤免疫逃逸。因此，本研究結(jié)果提示，PD－L1分子在CD4＋CD25hiCD127low／－Treg細胞上的表達水平升高可能導(dǎo)致了CD4＋CD25hiCD127low／－Treg細胞免疫抑制功能的提高，進而增強了對其他免疫細胞的抗腫瘤能力的抑制，而隨著腫瘤的進展PD－L1分子的表達水平隨之升高，CD4＋CD25hiCD127low／－Treg細胞的免疫抑制功能進一步增強。因此，PD－L1分子在Treg細胞上表達水平的監(jiān)測對評價結(jié)腸癌治療效果、疾病進展及預(yù)后具有重要價值。

［1］ Miska J，Abdulreda MH，Devarajan P，et al．Real－time immune cell interactions in target tissue during autoimmuneinduced damage and graft tolerance［J］．J Exp Med，2014，211（3）：441－456．

［2］ Rojo JM，Ojeda G，Acosta YY，et al．Characteristics of TCR／CD3complex CD3epsilon chains of regulatory CD4（＋）T（Treg）lymphocytes：role in Treg differentiation in vitro and impact on Treg in vivo［J］．J Leukoc Biol，2014，95（3）：441－450．

［3］ Rooney CM．Can Treg elimination enhance NK cell therapy for AML？［J］．Blood，2014，123（5）：3848－3849．

［4］ Sawant DV，Gravano DM，Vogel P，et al．Regulatory T cells limit induction of protective immunity and promote immune pathology following intestinal helminth infection［J］．J Immuno，2014，192（6）：2904－2912．

［5］ Vignali DA，Collison LW，Workman CJ．How regulatory T cells work［J］．Nat Rev Immunol，2008，8（7）：523－532．

［6］ Fontenot JD，Gavin MA，Rudensky AY．FOXP3programs the development and function of CD4＋CD25＋regulatory T cells［J］．Nature Immunol，2003，4（4）：330－336．

［7］ Liu WH，Putnam AL，Zhou XY，et al．CD127expression inversely correlateswith FoxP3and suppressive functionof human CD4＋T reg cells［J］．J Exp Med，2006（203）：1701－1711．

［8］ Seddiki N，Santner－Nanan B，Martinson J，et al．Expression of interleukin （IL）－2and IL－7receptors discriminates between human regulatory and activated T cells［J］．J Exp Med，2006，203（7）：1693－1700．

［9］ Dong H，Zhu G，Tamada K，et al．B7－H，a third member of the B7family，costimulates T－cell proliferation and interleukin－10secretion［J］．Nat Med，1999，5（12）：1365－1369．

［10］Cao YJ，Zhang L，Ritprajak P，et al．Immunoregulatory molecule B7－H1（CD274）contributes to skin carcinogenesis［J］．Cancer Res，2011，71（14）：4737－4741．

［11］Radvanyi L，Pilon－Thomas S，Peng W，et al．Antagonist antibodies to PD－1and B7－H1 （PD－L1）in the treatment of advanced human cancer［J］．Clin Cancer Res，2013，19（19）：1021－1034．

［12］Woo EY，Chu CS，Goletz TJ，et al．Regulatory CD4（＋）CD25（＋）T cells in tumors from patients with earlystage non－small cell lung cancer and late－stage ovarian cancer［J］．Cancer Res，2001，61（12）：4766－4772．

［13］Ichihara F，Kono K，Takahashi A，et al．Increased populations of regulatory T cells in peripheral blood and tumor－infiltrating lymphocytes in patients with gastric and esophageal cancers［J］．Clin Cancer Res，2003，9（12）：4404－4408．

［14］Salama P，Phillips M，Grieu F，et al．Tumor－Infiltrating FOXP3＋T regulatory cells show strong prognostic significance in colorectal cancer［J］．J Clin Oncol，2009，27（2）：186－192．

［15］Schaefer C，Kim GG，Albers A，et al．Characteristics of CD4＋CD25＋regulatory T cells in the peripheral circulation of patients with head and neck cancer［J］．Br J Cancer，2005，92（5）：913－920．

［16］Ormandy LA，Hillemann T，Wedemeyer H，et al．Increased populations of regulatory T cells in peripheral blood of patients with hepatocellular carcinoma［J］．Cancer Res，2005，65（6）：2457－2464．