時 燕，姜 鋒，卜 今，盧 紅△

（1.河南大學(xué)淮河醫(yī)院腫瘤科，河南開封475000；2.河南大學(xué)淮河醫(yī)院骨科，河南開封475000；3.南京醫(yī)科大學(xué)學(xué)報編輯部，南京210029）

骨巨細胞瘤（giant cell tumor of bone，GCT）被認為是一種具浸潤性生長，易復(fù)發(fā)的潛在惡性腫瘤，偶出現(xiàn)肺部轉(zhuǎn)移，局部侵襲性生長和術(shù)后復(fù)發(fā)比例均高達40%～50%，國內(nèi)的發(fā)病率為國外的2～3 倍，但是目前其生物學(xué)行為尚無法通過GCT 的病理學(xué)分級與影像學(xué)分型等組織學(xué)指標(biāo)評估［1-2］。近年研究表明，在腫瘤細胞侵襲及在腫瘤新生血管的形成過程中蛋白酶均發(fā)揮非常關(guān)鍵的作用，多種腫瘤的侵襲、轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)與基質(zhì)金屬蛋白酶（MMP）-7、MMP-9 和金屬蛋白酶組織抑制因子（TIMP）-3 的表達不平衡相關(guān)［3-4］。本實驗旨在通過免疫組織化學(xué)法檢測MMP-7、MMP-9、TIMP-3 和CD34 在GCT組織中的表達情況，并探討其與腫瘤血管形成及術(shù)后復(fù)發(fā)的關(guān)系。

1 資料與方法

1.1 一般資料 收集淮河醫(yī)院2000年3月至2008年5月骨外科手術(shù)收治的126例GCT 組織標(biāo)本，其中腫瘤復(fù)發(fā)病例54例（最短復(fù)發(fā)時間為3 個月，最長為48 個月，平均為23.8 個月），非復(fù)發(fā)病例72例（追蹤時間長達60 個月，未見復(fù)發(fā)）；男60 例，女66例，年齡17～65歲，平均（34.8±5.6）歲，按Jaffe分級為Ⅰ級42例，Ⅱ級72 例，Ⅲ級12 例。全部標(biāo)本均經(jīng)病理組織學(xué)證實。

1.2 方法 MMP-7、MMP-9 鼠抗人多克隆抗體，TIMP-3鼠抗人多克隆抗體和CD34鼠抗人單克隆抗體及通用型SP 檢測試劑盒均購自北京中杉生物技術(shù)有限公司。腫瘤組織標(biāo)本用10%中性福爾馬林固定，石蠟包埋，冷卻，4 ℃保存制成蠟塊，4 μm 連續(xù)切片，采用SP 法進行免疫組織化學(xué)染色，嚴格按試劑盒說明書進行操作。所有切片常規(guī)脫蠟，PBS 沖洗，3% H2O2室溫下孵育10min，使內(nèi)源性過氧化物酶失去活性，微波爐進行抗原修復(fù)，正常山羊血清封閉，滴加適當(dāng)比例稀釋的一抗，37℃孵育放置于4 ℃冰箱過夜，然后滴加生物素化二抗及過氧化物酶標(biāo)記的抗體，PBS 洗，DAB 顯色，蘇木素對比染色。其中CD34 染色前先行高溫高壓抗原修復(fù)，其余步驟按SP 法進行。以PBS 代替一抗作陰性對照。

1.3 染色結(jié)果判斷 MMP-7、MMP-9和TIMP-3陽性著色為棕黃色顆粒，位于細胞質(zhì)或細胞膜。著色程度：著色較深記3 分，著色適中記2分，著色較淡記1分和基本不著色記0分；著色細胞百分率：＞50%記3 分，25%～50%記2分，5%～＜25%記1 分，＜5%記0 分。上述兩項相乘，≤1 分為（-），2～4 分為（＋），5～7 分為（＋＋），≥8 分為（＋＋＋）。在高倍鏡下隨機選擇有代表性的5個不同視野計數(shù)100 個腫瘤細胞中的陽性細胞數(shù)。微血管密度（MVD）計數(shù)方法［5］：任何一個孤立的棕黃色內(nèi)皮細胞或細胞簇，均按獨立的微血管計數(shù)，不以有無血管腔及有無紅細胞作為判斷微血管的依據(jù)，已形成肌層的血管及分辨不清或染色模糊的細胞不計數(shù)。先在低倍鏡視野內(nèi)確定腫瘤組織內(nèi)微血管高密度的區(qū)域，再通過400倍鏡觀察計數(shù)，最后取5個視野內(nèi)微血管數(shù)目的平均值進行分析。

1.4 統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS13.0 軟件進行統(tǒng)計學(xué)分析，組間采用χ2檢驗分析，與MVD 的相關(guān)性采用Spearman相關(guān)分析處理，以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 MMP-7、MMP-9和TIMP-3 在GCT 組織中的表達 如圖1所示，免疫組織化學(xué)染色顯示MMP-7、MMP-9表達主要在多核巨細胞，在細胞質(zhì)內(nèi)分布不均勻，而在腫瘤與周圍組織交界處呈現(xiàn)高表達，另在單核基質(zhì)細胞質(zhì)內(nèi)可見有極少部分表達。TIMP-3則大部分表達于單核基質(zhì)細胞及多核巨細胞的胞質(zhì)和胞膜中，在腫瘤周圍成骨細胞和骨細胞也可見其表達。而CD34 表達于內(nèi)皮細胞。由表1結(jié)果顯示，MMP-7、MMP-9和TIMP-3 陽性率分別為97.6%、100.0%和92.8%。在復(fù)發(fā)組和非復(fù)發(fā)組間比較，MMP-7、MMP-9 表達和MVD 差異顯著（P＜0.01），TIMP-3表達差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。

2.2 MMP-7、MMP-9、TIMP-3 表達與MVD 的相關(guān)性 經(jīng)Spearman相關(guān)分析顯示，MMP-7、MMP-9 表達與MVD 存在正相關(guān)性（r＝0.895，P＝0.001；r＝0.271，P＝0.025），TIMP-3表達與MVD 不存在相關(guān)性（r＝-0.368，P＝0.063）。

圖1 GCT 組織免疫組織化學(xué)染色（×100）

表1 MMP-7、MMP-9、TIMP-3和MVD 在GCT 中的表達情況

3 討 論

GCT 是一種潛在的惡性腫瘤，具有低度侵襲性。目前在臨床病理診斷中尚沒有找到對治療和預(yù)后判斷有明顯指導(dǎo)意義的生物學(xué)行為指標(biāo)［6］。而部分患者往往由于手術(shù)方式不當(dāng)，出現(xiàn)手術(shù)預(yù)后差，復(fù)發(fā)較多，嚴重影響患者的生活質(zhì)量。因此，在判斷該腫瘤的生物學(xué)行為時迫切需要有一種可靠的指標(biāo)來為臨床治療提供幫助。

本實驗應(yīng)用多克隆抗體進行免疫組織化學(xué)間接法染色對GCT 中的MMP-7、MMP-9 和TIMP-3的表達量進行原位觀察。觀察結(jié)果顯示在特定的組織部位均有特異性的免疫組織化學(xué)染色棕黃色陽性反應(yīng)物的存在。如在多核巨細胞中MMP-7和MMP-9的量表達較多，在單核基質(zhì)細胞胞質(zhì)內(nèi)表達量極少；TIMP-3則集中表達于單核基質(zhì)細胞及多核巨細胞的胞質(zhì)和胞膜中。然而相反，在對照組切片中沒有觀察到陽性反應(yīng)物。由此表明，可以運用免疫組織化學(xué)方法成功地檢測出MMP-7、MMP-9和TIMP-3 在組織中的分布，彌補了許多診斷方法的不足。

MMP能介導(dǎo)腫瘤惡性生物過程的發(fā)生，是一類與腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移密切相關(guān)的蛋白水解酶。它不僅直接參與破壞組織，還誘導(dǎo)生成血管內(nèi)皮細胞生長因子（VEGF），進而刺激內(nèi)皮細胞合成蛋白酶，致使內(nèi)皮細胞的增殖和轉(zhuǎn)移，被認為是人體內(nèi)重要的血管生成誘導(dǎo)和調(diào)控因子［7］。Matsuura等［8］研究表明，MMP-7 的mRNA 在間葉軟骨肉瘤中呈低表達，而MMP-14的mRNA 表達較高。Mak等［9］研究發(fā)現(xiàn)，MMP-13是降解Ⅰ型膠原的重要酶，主要表達于GCT 的間質(zhì)細胞中，Runx2siRNA 參與其表達的調(diào)節(jié)作用。Cowan 等［10］的研究表明，在GCT 中，MMP-13 的表達量遠遠高于MMP-1，而MMP-8 不表達。因此，在GCT 中MMPs不同的亞型出現(xiàn)不一致表達，其原因目前還不清楚。MMP-7 是降解構(gòu)成ECM和BM 的重要成分，它在基質(zhì)細胞中不表達，而在正常黏膜上皮細胞中呈弱表達或不表達。MMP-9屬于Ⅳ型膠原酶，在腫瘤浸潤轉(zhuǎn)移過程中，發(fā)揮蛋白水解酶的作用，主要是通過降解以Ⅲ型、Ⅳ型膠原為主要成分的細胞外基質(zhì)和血管壁基膜的形式，并參與腫瘤血管的形成，多種腫瘤的惡性行為和預(yù)后與其表達升高有關(guān)［3，11-12］。本研究結(jié)果也顯示，MMP-7、MMP-9 的表達在復(fù)發(fā)組中均比非復(fù)發(fā)組要高，腫瘤血管形成在復(fù)發(fā)組也高于非復(fù)發(fā)組，而MMP-7、MMP-9 的表達均與MVD 呈正相關(guān)。

TIMP-3是一種能緊密結(jié)合細胞外基質(zhì)成分的非可溶性蛋白，在局部發(fā)揮作用，能比其他成員更有針對性的抑制MMP 活性及發(fā)揮其他生物學(xué)功能［13］。TIMP-3 按一定比例與MMP-9形成特異性復(fù)合物，首先通過抑制MMP-9活性阻止細胞外基質(zhì)的降解及促血管的生成，然而使內(nèi)皮細胞的增殖和轉(zhuǎn)移得到抑制。同時TIMP-3 還能抑制腫瘤血管形成，腫瘤的發(fā)展，其主要是通過抑制微血管內(nèi)皮細胞對生長因子的反應(yīng)，調(diào)節(jié)細胞增殖、促進細胞凋亡［14］。有關(guān)肺癌、前列腺癌等多種腫瘤的研究顯示，腫瘤細胞侵襲轉(zhuǎn)移能力與產(chǎn)生MMP-9的能力關(guān)系密切，通過選擇性地對MMP-9 表達抑制或TIMP-2、TIMP-3 表達增強均可在一定程度上使腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移得到抑制［4］。呂國麗等［15］通過TIMP-3 基因啟動子的甲基化實驗，得出GCT TIMP-3 低表達可促進腫瘤的發(fā)展，但也有研究［3］顯示在部分腫瘤中TIMP-3 高表達。在本實驗研究中，TIMP-3 在GCT 中的陽性表達率為92.8%，而復(fù)發(fā)組與非復(fù)發(fā)組之間比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。這可能是TIMP-3與腫瘤的增殖存在一定的關(guān)聯(lián)，但目前還不能考證其與腫瘤是否復(fù)發(fā)之間的關(guān)系。本實驗結(jié)果也顯示，雖然在GCT 復(fù)發(fā)組中TIMP-3和MMP-9 二者表達的失衡，TIMP-3無明顯升高，而MMP-9 高表達，這可能是由于其促進腫瘤細胞局部浸潤生長、腫瘤血管形成并導(dǎo)致腫瘤復(fù)發(fā)。MMP-7 與TIMP-3 之間的相關(guān)性有待進一步研究。綜上所述，建議對GCT MMP-7、MMP-9和MVD 進行檢測，其高表達則對預(yù)示復(fù)發(fā)有一定指導(dǎo)作用。

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