任明強，譚天海，蘇 俊

（遵義醫(yī)學院附屬醫(yī)院：1.血液科；2.病理科，貴州遵義563003）

混合細胞型霍奇金淋巴瘤是一種國內最常見的經典型霍奇金淋巴瘤，約占經典型霍奇金淋巴瘤的30%，主要在兒童和老年人中發(fā)?。?］。已有報道年齡、性別、TNM 分期、白細胞計數、淋巴細胞計數和結外累及是影響混合細胞型霍奇金淋巴瘤預后因素［2］。但是混合細胞型霍奇金淋巴瘤的診斷和預后分子標記物依舊存在較大爭議，缺乏特異相關的預后指標指導治療。T-cadherin屬于細胞黏附分子cadherin超家族的成員之一，因缺失cadherin分子中跨膜區(qū)被截短而得名（又稱CDH13或H-cadherin），研究發(fā)現T-cadherin在肺癌、肝癌、宮頸癌和結直腸癌等中存在顯著低表達或表達缺失，并影響腫瘤患者預后［3］。然而國內外尚缺乏T-cadherin對混合細胞型霍奇金淋巴瘤的相關研究。因此，本研究采用免疫組織化學法和RTPCR 檢測T-cadherin在混合細胞型霍奇金淋巴瘤患者淋巴結和骨髓細胞中的表達情況，探討T-cadherin能否成為混合細胞型霍奇金淋巴瘤發(fā)生、發(fā)展的分子標記物，為指導混合細胞型霍奇金淋巴瘤診斷和預后提供理論依據。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2002年2月至2010年2月遵義醫(yī)學院附屬醫(yī)院住院患者，其中混合細胞型霍奇金淋巴瘤45例為實驗組，其中男29例，女16例，年齡18～72歲，中位年齡43歲，TNM 分期Ⅰ、Ⅱ期共14例和Ⅲ、Ⅳ期共31例，均為淋巴結內原發(fā)病變。另取同時期淋巴結反應性增生的初治患者20例為對照組，男11例，女9例，年齡21～69歲，中位年齡41歲。診斷標準符合《張之南血液病診斷及療效標準》（第3版），所有患者均活檢淋巴結組織，并對標本制作石蠟冰凍切片保存；同時45例患者采集骨髓細胞用于RT-PCR檢測。

1.2 方法

1.2.1 免疫組織化學法 將石蠟標本包埋并制作2μm 連續(xù)病理切片，按照免疫組化染色說明書中的方法進行染色。DAB試劑盒和SP染色試劑盒均從重慶生物制品有限公司購買，兔抗人T-cadherin單克隆抗體購自上海Aviva Systems Biology公司。由兩位病理醫(yī)生進行雙盲閱片，結果取平均值。免疫組織化學結果判定標準：采用半定量對T-cadherin進行分析，按陽性細胞的染色強度記分等級為0分（陰性）、1分（弱陽性）、2分（中度陽性）和3分（強陽性）；按染色陽性細胞百分比記分等級為0分（＜10%細胞陽性）、1分（10%～25%細胞陽性）、2分（26%～50%細胞 陽 性）、3分（51%～75%細 胞 陽 性）、4 分（＞75%細胞陽性）；將染色強度和染色百分比相乘得到的分數即為最后染色水平分級：0～3分定義為陰性，4～12分定義為陽性。

1.2.2 RT-PCR法 根據Genbank中報道的人T-cadherin的基因序列，用Primer Pre-mier5.0軟件設計T-cadherin基因的引物序列。上游引物為5′-ACCCAGCAGGTTGGCTGAA-3′，下游引物為5′-CCTCCAGGGTTATCAGCAAAGTC-3′，長度174bp。以GAPDH 為內參照，設計特異性序列引物，上游引物為5′-TGGAAATCAATGGGAAGCAGG-3′，下游引物為5′-ATAGGTGAATCAGCAGATGGAGC-3′，長度190bp。引物均由大連寶生物工程公司合成。45例患者取相應骨髓5mL，用肝素抗凝后，使用淋巴細胞分離液分離骨髓單個核細胞，并計數（5～10）×106細胞與Trizol總RNA 提取液1mL 混勻，凍存于-20 ℃環(huán)境中。采用Trizol法一步提取骨髓單個核細胞的總RNA。產物用20μL 的DEPC 水溶解。RNA 完整度檢測用電泳法，RNA 含量和純度的計算則用紫外分光光度計測量。提取1μL的總RNA 來構成10μL反應體系，并參照逆轉錄試劑盒說明書以進行cDNA 合成。將cDNA 用于進一步常規(guī)PCR 擴增。條件為：94 ℃預變性1min，94 ℃30s，58 ℃30s，71 ℃40s，共30個循環(huán)，最后72 ℃延伸5min。

1.3 研究內容 分析混合細胞型霍奇金淋巴瘤和淋巴結反應性增生患者中T-cadherin表達情況，混合細胞型霍奇金淋巴瘤患者臨床病理特征年齡、性別、WBC、PLT、Hb、LDH、TNM 分期和結外累及與T-cadherin表達強度的關系；將年齡、性別、WBC、PLT、Hb、LDH、TNM 分期、結外累及和T-cadherin陽性表達納入混合細胞型霍奇金淋巴瘤患者結外累及多因素Logistic回歸分析；并對混合細胞型霍奇金淋巴瘤患者進行5年隨訪，分析T-cadherin陽性表達和遠期預后的關系?；旌霞毎突羝娼鹆馨土鲆痪€方案選ABVD 經4～6個療程后判斷療效。第1年每3月進行1次隨訪，第2年以后每6個月進行1次隨訪，以2、3和5年的總生存率為遠期預后評價指標，并繪制兩組患者的生存曲線，比較兩組患者的遠期預后療效。

1.4 統(tǒng)計學處理 采用SPSS16.0軟件進行統(tǒng)計學分析，對計數資料采用χ2檢驗，多因素Logistic回歸分析混合細胞型霍奇金淋巴瘤患者結外累及與臨床病理特征的關系。兩組生存資料采取Kaplan-Meier方法繪制生存曲線，采用Log-rank檢驗分析組間差異。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結 果

2.1 T-cadherin在混合細胞型霍奇金淋巴瘤和淋巴結反應性增生患者中的表達 T-cadherin的表達主要定位于細胞膜上，其在混合細胞型霍奇金淋巴瘤和淋巴結反應性增生患者中的陰性表達分別為68.9%和10.0%，陽性表達分別為31.1%和90.0%，兩組間差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），見圖1、表1。

表1 T-cadherin在混合細胞型霍奇金淋巴瘤和淋巴結 反應性增生患者中的表達［n（%）］

圖1 T-cadherin在混合細胞型霍奇金淋巴瘤與淋巴結反應性增生中的表達（SP×400）

2.2 T-cadherin mRNA 在混合細胞型霍奇金淋巴瘤和淋巴結反應性增生的相對表達量 T-cadherin mRNA 在混合細胞型霍奇金淋巴瘤中表達顯著減少，相對表達量為0.36±0.03，而在淋巴結反應性增生中大量表達，相對表達量為0.87±0.07，二者間差異有統(tǒng)計學意義（t＝31.33，P＜0.05）。這一結果和免疫組化蛋白表達趨勢結果相一致。

2.3 T-cadherin表達與混合細胞型霍奇金淋巴瘤臨床特征的關系 混合細胞型霍奇金淋巴瘤中T-cadherin 表達與患者TNM 分期和結外累及有關（P＜0.05），與患者年齡、性別、WBC、PLT、Hb、LDH 和IPS評分無相關性（P＞0.05），見表2。

表2 T-cadherin表達與混合細胞型霍奇金淋巴 瘤臨床特征的關系（n）

續(xù)表2 T-cadherin表達與混合細胞型霍奇金淋巴 瘤臨床特征的關系（n）

2.4 混合細胞型霍奇金淋巴瘤患者結外累及與臨床病理特征的關系 在混合細胞型霍奇金淋巴瘤患者中，結外累及與年齡、性別、WBC、PLT、Hb和LDH 無關（P＞0.05），與TNM 分期和T-cadherin陰性表達有關（P＝0.012、0.008）。多因素Logistic回歸分析顯示，影響混合細胞型霍奇金淋巴瘤患者結外累及OR由大到小依次為T-cadherin陰性表達、TNM 分期、性別、年齡、PLT、WBC、Hb和LDH，見表3。

表3 結外累及與臨床病理特征的多因素 Logistic回歸分析

2.5 混合細胞型霍奇金淋巴瘤患者T-cadherin表達與生存預后的關系 經過Log-rank檢驗顯示，混合細胞型霍奇金淋巴瘤患者T-cadherin陰性表達和T-cadherin陽性表達的2年生存率分別是83.9%和92.9%（P＞0.05）；3年生存率分別是71.0%和85.7%（P＞0.05）；5年生存率分別是41.9%和78.6%（P＝0.024），見表4。同時繪制Kaplan-Meier圖，顯示T-cadherin陰性表達5年生存率明顯低于T-cadherin陽性表達（P＝0.038），見圖3。

表4 T-cadherin表達與混合細胞型霍奇金淋巴 瘤患者生存率［n（%）］

圖3 T-cadherin表達與混合細胞型霍奇金淋巴瘤患者生存曲線

3 討 論

混合細胞型霍奇金淋巴瘤是一種以R-S細胞為主，并伴有嗜酸細胞、淋巴細胞、漿細胞等多種細胞常見的經典型霍奇金淋巴瘤，活檢可見以瘤細胞CD30、CD15、PAX-5 染色陽性及IgH、TCR 基因重排為特征［4-5］?；旌霞毎突羝娼鹆馨土龃嬖诓ドA向，生存期相對短、易復發(fā)等特點，部分患者預后差。目前，霍奇金淋巴瘤治療及預后相關因素是研究熱點，不同的研究中提出了不同的臨床預后因素，霍奇金淋巴瘤的預后因素仍未統(tǒng)一［6］。

T-cadherin屬于細胞黏附分子cadherin超家族，主要通過調節(jié)鈣介導的細胞黏附、細胞極性及形態(tài)形成、細胞聚集和遷移、細胞識別和信號轉導［7］。T-cadherin表達缺失使細胞間黏附力減弱，從而促進腫瘤細胞轉移，與腫瘤發(fā)展及轉移呈負相關［8］。目前，T-cadherin在多種腫瘤（胃癌、鼻咽癌、結直腸癌、肝癌、宮頸癌、乳腺癌等）中呈低表達，并且是不良預后指標［9-11］。而cadherin超家族中，E-cadherin對維持上皮細胞形態(tài)和結構完整性有著重要作用，N-cadherin則會促進癌細胞從癌組織脫落并使其與正常內皮或基質黏附。目前暫缺混合細胞型霍奇金淋巴瘤中T-cadherin表達研究的報道，混合細胞型霍奇金淋巴瘤預后與多種因素有關，但多數標志與患者預后的關系仍不十分清楚［12］。在本研究中發(fā)現在混合細胞型霍奇金淋巴瘤中T-cadherin呈顯著低表達，結果顯示T-cadherin在混合細胞型霍奇金淋巴瘤中的陽性表達顯著低于淋巴結反應性增生（P＜0.05），在國內多項研究發(fā)現T-cadherin在鼻咽癌、胃癌等腫瘤中陽性表達也顯著降低［13］。同時采用RT-PCR 檢測結果顯示T-cadherin mRNA 在混合細胞型霍奇金淋巴瘤中相對表達量顯著低于淋巴結反應性增生（P＜0.05），這一結果和免疫組織化學結果類似。進一步分析T-cadherin表達與臨床預后等相關因素間關系，表明混合細胞型霍奇金淋巴瘤患者T-cadherin表達與年齡、性別、WBC、PLT、Hb、LDH 和IPS評分無相關性（P＞0.05），與TNM 分期和結外累及相關（P＜0.05），表明低表達T-cadherin的混合細胞型霍奇金淋巴瘤侵襲性強、危險度高、病情易進展。結外累及作為獨立重要預后因素，在多因素Logistic回歸分析中，顯示TNM 分期和Tcadherin陰性表達是混合細胞型霍奇金淋巴瘤患者結外累及的獨立危險因素，表現T-cadherin陰性表達與結外累及密切關系，提示T-cadherin為判斷混合細胞型霍奇金淋巴瘤預后有重要價值。分析其作用機制，主要是T-cadherin基因啟動子甲基化導致T-cadherin 蛋白表達顯著降低或缺失；同時，Twist、ZEB1、Snail等多種轉錄因子可直接抑制T-cadherin 轉錄；PI3K／AKT、Ras／Raf等多種信號轉導途徑可活化核內轉錄因子以抑制T-cadherin表達［14］；T-cadherin蛋白的缺失使得腫瘤間黏附力減弱，從而導致腫瘤細胞的浸潤和轉移［15］。此外，隨訪5年顯示混合細胞型霍奇金淋巴瘤患者T-cadherin陰性表達生存率明顯低于T-cadherin陽性表達患者，并隨著時間的推移兩組間生存率的差異逐漸增加，這可能和T-cadherin隨著腫瘤的進展而呈進行性丟失有關。

由此可以推斷T-cadherin表達減少在混合細胞型霍奇金淋巴瘤中與臨床預后密切相關，T-cadherin可能成為混合細胞型霍奇金淋巴瘤預后相關的重要分子標記物，為進一步指導混合細胞型霍奇金淋巴瘤臨床治療提供初步理論依據。

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