王義旺，胡祥上，全慶麗，姜海鷗△

（1.湖南醫(yī)藥學(xué)院附屬醫(yī)院／懷化市第一人民醫(yī)院耳鼻喉科，湖南懷化418000；2.湖南醫(yī)藥學(xué)院醫(yī)學(xué)遺傳學(xué)教研室，湖南懷化418000）

耳聾是最常見的感覺障礙性疾病之一，在新生兒中發(fā)病率約為1／1 000。按表型特征不同，遺傳性耳聾可分為綜合征型耳聾（syndromic hearing loss，SHL）和非綜合征型耳聾（nonsyndromic hearing loss，NSHL）［1］。NSHL可表現(xiàn)為多種遺傳方式，包括常染色體顯性遺傳，常染色體隱性遺傳，X 連鎖遺傳，Y 連鎖遺傳和線粒體遺傳等。遺傳性耳聾具有高度的遺傳異質(zhì)性。迄今為止，共定位NSHL 基因位點(diǎn)136個(gè)，已克隆的致病基因有60余個(gè)，其中導(dǎo)致遺傳性NSHL的基因中，GJB2、SLC26A4、MYO15A、OTOF、CDH23和TMC1等基因突變較為常見，其中又以GJB2 基因突變最為常見［2］，在我國(guó)約18.31%的耳聾患者是由GJB2 基因突變導(dǎo)致的［3］。鑒此，作者對(duì)1個(gè)遺傳性NSHL 家系成員的GJB2基因編碼序列進(jìn)行分析，旨在尋找耳聾患者的致病基因突變。

1 資料與方法

1.1 一般資料 該家系4代共14人，其中耳聾患者4例（圖1）。先證者（Ⅲ2），男，42歲，12歲起雙側(cè)耳鳴并進(jìn)行性聽力減退，36歲發(fā)展為全聾。純音測(cè)聽顯示左耳聽力為85分貝，右耳聽力為80分貝，屬于重度耳聾。除耳聾之外，不伴其他器官系統(tǒng)的異常。該家系耳聾患者的起病年齡為12～25 歲，其他患者與先證者臨床癥狀相似。臨床表現(xiàn)為雙側(cè)耳鳴，聽力減退為雙耳對(duì)稱性、以高頻聽力下降為主的感覺神經(jīng)性耳聾。耳部CT 掃描、前庭功能及全身體格檢查，均未發(fā)現(xiàn)異常。

圖1 患者家系圖

表1 PCR 擴(kuò)增GJB2基因的引物

1.2 方法

1.2.1 DNA 制備 在獲得知情同意之后，采集該家系9個(gè)成員的外周血樣本，包括3例患者（Ⅱ2、Ⅱ5、Ⅲ2）和6名健康人（Ⅱ1、Ⅱ3、Ⅱ6、Ⅲ1、Ⅲ5、Ⅳ1）。血液基因組DNA 提取試劑盒購(gòu)自北京天根生化公司（批號(hào)DP318），按產(chǎn)品說(shuō)明書介紹的方法提取基因組DNA。DNA 濃度測(cè)定后稀釋成為25ng／μL 工作液。

1.2.2 PCR 擴(kuò)增應(yīng)用Primer5軟件設(shè)計(jì)并合成3對(duì)引物（表1），擴(kuò)增區(qū)域覆蓋GJB2基因的兩個(gè)外顯子及外顯子與內(nèi)含子交界區(qū)域。PCR 反應(yīng)體系：總體積為15μL，2×GC buffer 7.50μL（含MgCl210 mmol／L），dNTP 混合液（10 mmol／L）0.75μL，正反向引物（10μmol／L）各0.75μL，模板基因 組DNA 0.03μg，rTaq DNA 聚合酶（5U／μL）0.80μL，雙蒸水補(bǔ)至15.00μL。反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性10min、95 ℃變性30s、55～60℃退火30s、72℃延伸45s，35個(gè)循環(huán)，72℃再延伸10 min。PCR 產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠，恒壓140V 電泳25min，溴化乙錠／紫外線觀察，以證實(shí)PCR 擴(kuò)增的片段。

1.2.3 產(chǎn)物純化、序列測(cè)定及分析 PCR 產(chǎn)物純化（生工SK1141）后送至上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司，在ABI3730自動(dòng)測(cè)序儀上應(yīng)用相應(yīng)的PCR 引物進(jìn)行雙向直接序列測(cè)定，測(cè)序結(jié)果使用DNAStar軟件進(jìn)行分析。發(fā)現(xiàn)的序列變異在NCBI和Hapmap的多態(tài)數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行查詢，確定是否為單核苷酸多態(tài)（single nucleotide polymorphism，SNP）。通過(guò)同時(shí)檢測(cè)家系內(nèi)所有患者及其健康同胞的相應(yīng)序列，鑒定變異序列是否與疾病表型共分離。

2 結(jié) 果

該家系共有存活耳聾患者3例，從家系圖分析，符合常染色體顯性遺傳；所有患者均為語(yǔ)后聾，為雙耳對(duì)稱性、進(jìn)行性、高頻聽力下降為主的感覺神經(jīng)性聾，隨年齡增加耳聾程度逐步加重，最終進(jìn)展為全頻受累的重度感音神經(jīng)性聾?；颊叱霈F(xiàn)聽力下降的年齡，從12～25歲。Ⅱ2，女，65歲，16歲出現(xiàn)聽力下降，48歲發(fā)展為全聾，目前左耳聽力為75分貝，右耳聽力為80分貝。Ⅱ5，男，55歲，25 歲出現(xiàn)聽力下降，42 歲發(fā)展為全聾，目前左耳聽力為85分貝，右耳聽力為84分貝。

直接雙向測(cè)序后，發(fā)現(xiàn)GJB2基因的6個(gè)變異序列（表2、圖2），這些變異既存在于部分患者中，也在健康親屬中檢測(cè)到，與疾病不存在共分離。本研究中發(fā)現(xiàn)的GJB2基因的核苷酸改變是SNP。

圖2 GJB2基因中檢測(cè)到的核苷酸變異序列

表2 GJB2基因中檢測(cè)到的變異序列

3 討 論

耳聾是導(dǎo)致交流障礙最常見的疾病，大多數(shù)發(fā)病都與遺傳有關(guān)。遺傳性耳聾患者中70%以上為NSHL。耳聾具有高度的遺傳異質(zhì)性，相關(guān)基因眾多，但在不同人群中GJB2基因突變均是導(dǎo)致NSHL的最主要致病基因［4］。Mignon 等［5］于1996年將人類GJB2定位于13q11-q12，基因全長(zhǎng)5 510bp，含兩個(gè)外顯子，而編碼序列位于exon2，長(zhǎng)為681bp。GJB2含有226個(gè)氨基酸的蛋白質(zhì)，相對(duì)分子質(zhì)量約為26×103，也稱縫隙連接蛋白26（connexin 26，Cx26）。Cx26是一種跨膜蛋白，4次跨膜，共分5個(gè)區(qū)：N 端區(qū)、跨膜區(qū)、細(xì)胞外區(qū)、胞漿內(nèi)連接區(qū)和C端區(qū)。Cx26蛋白以六聚體形式結(jié)合形成縫隙連接，形成耳蝸內(nèi)鉀離子運(yùn)輸通道，以維持耳蝸內(nèi)較高水平電位［6］。GJB2基因突變可導(dǎo)致Cx26 蛋白功能缺陷，減少鉀離子再循環(huán)效率，進(jìn)而導(dǎo)致聽力損害［7］。目前發(fā)現(xiàn)，GJB2至少有111種突變可以引起NSHI，其中顯性突變9 種，隱性突變92 種，遺傳模式不明突變10種。

本研究的NSHL家系中，所有患者均為語(yǔ)后聾，為雙耳對(duì)稱性、進(jìn)行性、高頻聽力下降為主的感覺神經(jīng)性聾，不伴其他器官系統(tǒng)的異常。根據(jù)其臨床特征和遺傳方式，作者認(rèn)為該家系屬于常染色體顯性遺傳的非綜合征型耳聾。進(jìn)一步用分子遺傳學(xué)方法嘗試了GJB2 基因的突變篩查，尋找患者特有的突變。檢測(cè)到的6個(gè)變異序列既存在于患者中，也出現(xiàn)在患者的健康親屬中，未發(fā)現(xiàn)與疾病表型共分離的變異。其中c.79G＞A（p.Val27Ile）和c.341G＞A（p.Glu114Gly）為已報(bào)道的核苷酸多態(tài)，而位于3′-UTR 的g.4159T＞C、g.5142G／T、g.5227G／A、g.5352T／C突變?yōu)楸狙芯繃?guó)內(nèi)外首次報(bào)道。盡管本研究在GJB2基因的編碼區(qū)發(fā)現(xiàn)了2個(gè)雜合突變79G＞A（p.Val27Ile）和341G＞A（p.Glu114Gly），但在該家系患者和健康人中均存在這些突變，因此，作者認(rèn)為它們更可能是該基因的SNP，這與大多數(shù)研究者認(rèn)為雜合突變79G＞A 和341G＞A是GJB2基因的多態(tài)相一致的［8-10］。所以，作者初步排除了GJB2為本研究NSHL家系的致病基因，說(shuō)明遺傳性非綜合征型耳聾存在明顯的遺傳異質(zhì)性。

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