秦延海，古麗扎爾·買買提明，帕麗達(dá)·阿不來提

（新疆醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院干部病房?jī)?nèi)二科，烏魯木齊830000）

細(xì)胞色素氧化酶P450 2C19是細(xì)胞色素氧化酶P450超家族中的重要成員，也是人體中重要的藥物代謝酶，催化代謝許多內(nèi)源性底物及臨床上大約2%的藥物，包括：血小板抑制劑、質(zhì)子泵抑制劑、抗精神病藥、降糖藥等［1］?，F(xiàn)已證實(shí)，CYP2C19基因多態(tài)性是引起個(gè)體間和種族間對(duì)同一藥物表現(xiàn)出不同代謝能力的最主要原因［2］，臨床上氯吡格雷代謝受CYP2C19基因多態(tài)性的影響明顯。CYP2C19 基因包括多種突變體，其中野生型為CYP2C19＊1，CYP2C19＊2 和CYP2C19＊3為主要突變體，其他突變體較罕見。CYP2C19＊2為外顯子5上的m1突變，即第681位堿基發(fā)生變異（G-A），CYP2C19＊3為外顯子4上的m2突變，即第636位處的堿基變異（G-A），且均為等位基因堿基的突變，形成雜合子或純合子突變，從而呈現(xiàn)常見的6種基因型，其中＊1／＊1，＊1／＊2，＊1／＊3基因型的表現(xiàn)型為快代謝型或正常代謝型；＊2／＊2、＊3／＊3、＊2／＊3基因型的表現(xiàn)型為慢代謝型［3］。由于藥物代謝酶P450 在人群中表現(xiàn)為快慢代謝型主要?dú)w根于CYP2C19基因的單核苷酸多態(tài)性，故對(duì)CYP2C19進(jìn)行基因型分類，研究不同種族間的基因型分布特點(diǎn)，對(duì)臨床指導(dǎo)用藥具有重要的意義［4-5］。

新疆地區(qū)維吾爾族、哈薩克族人口眾多，由于各民族間飲食及生活方式的不同，繼而導(dǎo)致冠心病及2型糖尿病的發(fā)病率不同。氯吡格雷是噻吩并吡啶類衍生物，是一種前體藥物，必須通過CYP450酶代謝，生成具有抑制血小板聚集作用的活性代謝產(chǎn)物，達(dá)到抑制血小板聚集的目的。但是氯吡格雷抵抗（CR）的存在卻嚴(yán)重影響著治療效果，從而導(dǎo)致臨床預(yù)后差。雖然目前尚未闡明CR 的確切機(jī)制，但是基因多態(tài)性被廣泛認(rèn)為是最重要的原因之一［6］。作者通過研究維吾爾族、哈薩克族和漢族人群CYP2C19的等位基因和基因型分布情況，并將各民族的結(jié)果進(jìn)行比較，考察民族差異性對(duì)CYP2C19基因多態(tài)性的影響，對(duì)于冠心病患者進(jìn)行個(gè)體化用藥指導(dǎo)。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取本院干部?jī)?nèi)二科住院體檢患者750例，漢族264例，維吾爾族276例，哈薩克族210例；男512例，女238例，平均年齡60.3 歲，確診冠心病患者520 例，并給予冠心病二級(jí)預(yù)防用藥。通過詢問、記錄受試者的家族史來判斷其無血緣關(guān)系，所有受試者暫無重大疾病，如嚴(yán)重的心功能不全，肝腎功能損害，冠脈搭橋術(shù)后及短期內(nèi)外傷手術(shù)史，所有受試者均知曉該檢查的目的，并同意抽血檢查。

1.2 方法

1.2.1 樣本的收集 靜脈取血2～3mL，加置EDTA 抗凝管（紫頭管）中，1～2h內(nèi)送檢。

1.2.2 DNA 的提取及PCR 擴(kuò)增 采用全血基因組DNA 提取試劑盒（上海白鷗生物技術(shù)有限公司），根據(jù)說明書要求提取和純化外周血DNA。引物采用Primer5.0 軟件進(jìn)行引物設(shè)計(jì)，上游引物：5′-AGG GAT AGT ATG AGG GAG GA-3′，下游引物：5′-CAA AAG CCG ATG TAG GTC-3′（由上海捷瑞生物工程有限公司合成）。CYP2C19＊2 位點(diǎn)及CYP2C19＊3位點(diǎn)擴(kuò)增條件為95 ℃5min起始模板變性，變性95 ℃30s，退火46℃30s，延伸72℃45s，共35個(gè)循環(huán)，最后72℃延伸10 min。分別生成CYP2C19＊2、CYP2C19＊3的等位基因擴(kuò)增片段，37 ℃水浴4h，用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2%瓊脂糖凝膠（加入核酸染料GELVIEW）100V 電泳。30min后在紫外線下觀察、攝影。將PCR產(chǎn)物及酶切產(chǎn)物與DNA marker比較，確定基因型。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS17.0軟件進(jìn)行分析，用Hardy-Weinberg平衡檢驗(yàn)樣本的群體代表性，基因型頻率和等位基因頻率采用基因計(jì)數(shù)法計(jì)算，計(jì)數(shù)資料以百分率表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn)，檢驗(yàn)水準(zhǔn)α＝0.05，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 漢族、維吾爾族、哈薩克族CYP2C19代謝表型分布 基因型為＊1／＊1者代謝表型為快代謝型純合子；＊1／＊2，＊1／＊3基因型的表現(xiàn)型為快代謝型雜合子；＊2／＊2、＊2／＊3、＊3／＊3基因型的為慢代謝型，見表1。3個(gè)民族間的CYP2C19代謝型分布差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2＝25.1，P＜0.05），漢族的慢代謝型明顯多于哈薩克族和維吾爾族，維吾爾族和哈薩克族快代謝型純合子明顯多于漢族。單獨(dú)維吾爾族和哈薩克族之間CYP2C19代謝型分布差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＝0.338）。

2.2 維吾爾族與漢族CYP2C19基因型和等位基因頻率的比較 維吾爾族快代謝型基因頻率為94.2%，明顯高于漢族的89.0%；慢代謝型基因頻率為5.8%，明顯低于漢族11.0%。等位基因CYP2C19＊1頻率維吾爾族為78.4%，明顯高于漢族；CYP2C19＊2頻率維吾爾族的18.3%低于漢族的30.1%；CYP2C19＊3頻率低于漢族。見表2。

表1 3民族CYP2C19代謝表型分布［n（%）］

2.3 哈薩克族與漢族CYP2C19基因型及等位基因頻率的比較 哈薩克族快代謝型基因頻率為93.8%高于漢族的89.0%，慢代謝型基因頻率為6.2%低于漢族的11.0%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＝0.006）。哈薩克族等位基因CYP2C19＊1頻率為76.2%，明顯有別于漢族的54.4%；哈薩克族的CYP2C19＊2等位基因頻率21.4%低于漢族42.0%，兩民族間的等位基因頻率差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＝0.026），見表2。

2.4 維吾爾族與哈薩克族CYP2C19基因型和等位基因頻率的比較 哈薩克族快代謝型基因頻率93.8%與維吾爾族的94.2%，慢代謝型基因頻率為6.2%與維吾爾族的5.8%，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＝0.338）。哈薩克族和維吾爾族等位基因CYP2C19＊1、CYP2C19＊2、CYP2C19＊3的分布差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），見表2。

表2 3民族基因型比較［n／n（%）］

3 討 論

遺傳多態(tài)性指在特定人群中，染色體的同一位點(diǎn)存在兩種或多種不連續(xù)的變異型或基因型，主要包括基因多態(tài)性、染色體多態(tài)性、酶多態(tài)性等。其中與多種藥物代謝相關(guān)的CYP2C19基因多態(tài)性為先天性遺傳，后天的疾病多不會(huì)改變?cè)摶蛐?，同時(shí)不受性別和年齡的影響［7］?；蚨鄳B(tài)性表現(xiàn)為明顯的種族差異性，不同的民族之間也有所不同，所以開展我國人群的基因多態(tài)性與環(huán)境的作用關(guān)系的研究同樣具有重要的意義。已有研究提示，在我國各民族間存在CYP2C19基因型差異，且該基因多態(tài)性具有一定的可比性，由于各民族間遺傳背景的不同，各民族間的基因頻率也各不相同［8］。已有研究發(fā)現(xiàn)亞洲人群中幾乎100%的弱代謝歸因于CYP2C19＊2和CYP2C19＊3所編碼功能缺陷等位基因［9］。CYP2家族不僅存在于心血管系統(tǒng)，同時(shí)參與多種重要藥物代謝，包括ADP受體阻滯劑（氯吡格雷）、質(zhì)子泵抑制劑（奧美拉唑）、抗癲癇藥（丙戊酸鈉）等［10］。對(duì)于本文來說，了解本地區(qū)3民族間的基因分型特點(diǎn)，可用于指導(dǎo)臨床合理用藥，指導(dǎo)氯吡格雷在冠心病患者中的使用情況，以個(gè)體化用藥達(dá)到更好的臨床效益。

CYP2C19基因多態(tài)性直接影響外源性物質(zhì)如藥物代謝強(qiáng)度及血藥濃度，其參與的藥物代謝對(duì)于某些疾病的預(yù)防、疾病的發(fā)生、預(yù)后影響明顯。經(jīng)由CYP2C19酶代謝的藥物，血濃度受人體基因型影響?？齑x型個(gè)體血濃度低，效應(yīng)減弱，可能導(dǎo)致治療無效，慢代謝型個(gè)體則效應(yīng)增強(qiáng)，容易產(chǎn)生不良反應(yīng)。弱代謝型、中間代謝型的受試者氯吡格雷活性代謝物的濃度水平比強(qiáng)代謝型低，活性代謝物主要起抑制血小板的作用，故血小板聚集率較強(qiáng)代謝型高，主要心血管不良事件及支架內(nèi)血栓形成的概率提高。對(duì)于此類患者可通過加強(qiáng)氯吡格雷藥物劑量，或是聯(lián)合用藥。還可以將氯吡格雷換為新型P2Y12拮抗劑普拉格雷或替格瑞洛。否定以往的模式化、常規(guī)化用藥，達(dá)到真正個(gè)體化用藥［11］。但藥物于人體的處置代謝過程十分復(fù)雜，因此臨床上用藥還應(yīng)根據(jù)患者臨床表現(xiàn)做出處理。馮端浩等［12］研究發(fā)現(xiàn)對(duì)于ADP 抑制率明顯低的突變基因純合子或雜合子組（CYP2C19＊2／＊2、CYP2C19＊3／＊3 和CYP2C19＊2／＊3）的患者，單純的提高氯吡格雷的用藥劑量，仍不能提高其抑制血小板的效果，建議此類基因型患者使用聯(lián)合用藥方案。本研究中漢族人口＊2、＊3等位基因所占的比例分別為30.1%、4.4%；維吾爾族中＊2、＊3等位基因所占的比例分別為18.3%、3.3%；哈薩克族中＊2、＊3等位基因所占的比例分別為21.4%、2.4%；本研究漢族人群發(fā)生＊2、＊3的雜合型突變率較高，高于維吾爾族和哈薩克族的＊2、＊3等位基因的分布比率，該突變大多為雜合突變，漢族的慢代謝型明顯高于2個(gè)少數(shù)民族，可以說明3個(gè)民族間的CYP2C19基因多態(tài)性具有一定的可比性。這與牛春燕等［13］的研究結(jié)果相一致。維吾爾族與哈薩克族間基因頻率分布具有差異性，具體各等位基因或基因型間的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。本研究初步顯示，CYP2C19的基因多態(tài)性存在明顯的民族間差異，通過了解該地區(qū)人群的基因分布頻率，可用于指導(dǎo)臨床用藥。即指導(dǎo)冠心病患者抗血小板治療氯吡格雷應(yīng)用，對(duì)于氯吡格雷抵抗與CYP2C19基因多態(tài)性的關(guān)系還需進(jìn)一步研究隨訪。

目前臨床上檢測(cè)CYP2C19 基因的多態(tài)性的方法有多種并各具優(yōu)缺點(diǎn)。如熒光定量PCR 和基因芯片檢測(cè)成本較高；焦磷酸測(cè)序較直接測(cè)序法提高了特異性和靈敏度，但檢測(cè)周期和費(fèi)用不能滿足臨床需要；特異性和靈敏度較高的多重PCR點(diǎn)突變篩查技術(shù)，因其高效、廉價(jià)的特點(diǎn)逐漸成為主導(dǎo)的檢測(cè)手段［14］。通過檢測(cè)基因型來評(píng)估判斷患者使用相關(guān)藥物治療的有效性，即有利于患者的個(gè)體化治療還可以降低藥物不良事件的發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)。隨著人們對(duì)基因組學(xué)的進(jìn)一步了解，CYP2C19基因檢測(cè)手段的改進(jìn)，P450酶被全面熟知，患者便可以從基因指導(dǎo)用藥方面最大的獲益。面對(duì)臨床復(fù)雜的臨床用藥還應(yīng)考慮多位點(diǎn)、多因素綜合影響，結(jié)合特定位點(diǎn)基因突變對(duì)用藥方案進(jìn)行預(yù)測(cè)和調(diào)整。

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