張軍輝，嚴家芹，趙玉林

（1.鄭州大學第三附屬醫(yī)院耳鼻咽喉科，鄭州450052；2.鄭州大學第一附屬醫(yī)院腫瘤科，鄭州450003；

3.鄭州大學第一附屬醫(yī)院耳鼻咽喉科，鄭州450003）

在世界范圍內(nèi)頭頸部鱗狀細胞癌是第六大常見惡性腫瘤，每年約60萬新發(fā)確診病例［1］，喉鱗狀細胞癌是頭頸部區(qū)域第2個最常見的惡性腫瘤［2-3］。雖然近年來喉癌患者的綜合治療有很大的發(fā)展，但總的生存率仍然很低，喉癌患者死亡的主要原因之一就是侵襲轉移［4］。近年來發(fā)現(xiàn)熊果酸具有抑制腫瘤細胞增殖和侵襲的作用，目前還沒有熊果酸作用于人喉癌Hep-2細胞的國內(nèi)外相關報道。本實驗主要檢測熊果酸對喉癌Hep-2細胞增殖和侵襲能力的影響，并分析其機制，為熊果酸應用于喉癌治療提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料 人喉癌Hep-2細胞株購自南京凱基生物有限公司；RPMI-1640培養(yǎng)基、胎牛血清購自杭州吉諾生物醫(yī)藥技術有限公司、杭州四季青工程材料有限公司；噻唑藍（MTT）、Transwell小室購自美國Sigma公司、Corning公司；NF-κB 和βactin抗體購自Santa Cruz公司；辣根過氧化酶標記物山羊抗小鼠IgG（二抗）購自北京中杉金橋生物技術有限公司；明膠蛋白購自Amersco公司；熊果酸購自美國Sigma公司，溶于RPMI-1640培養(yǎng)基制成10mmol／L 的母液，過濾除菌后-20 ℃?zhèn)溆谩?/p>

1.2 方法

1.2.1 細胞培養(yǎng) 人喉癌Hep-2細胞接種于RPMI-1640培養(yǎng)液（含10%胎牛血清），37 ℃、5%CO2及飽和濕度培養(yǎng)箱培養(yǎng)，每2天換1次培養(yǎng)液，實驗時取對數(shù)生長期細胞。

1.2.2 MTT 法測定細胞增殖抑制效應 消化收集對數(shù)生長期細胞，計數(shù)并用含10%胎牛血清的培養(yǎng)液調(diào)整細胞濃度7.5×104個細胞／mL細胞懸液，按每孔100μL 接種于96 孔板。待細胞貼壁后進行分組，實驗組加入熊果酸終濃度為0、12.5、25.0、50.0μmol／L 的培養(yǎng)基，陰性對照和空白對照，每組設6個復孔。在培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)12、24、36、48、60、72h后加入MTT 繼續(xù)培養(yǎng)4h，棄培養(yǎng)液后加入DMSO 振蕩10 min，檢測各孔吸光度（A）值計算細胞增殖抑制率。增殖抑制率（%）＝（對照組A值-給藥組A值）／對照組A值×100%。

1.2.3 Transwell小室侵襲實驗檢測熊果酸對Hep-2細胞侵襲能力的影響 冰上將Matrigel用冷的無血清的RPMI-1640培養(yǎng)基按1∶8稀釋，加入24孔板Transwell小室濾膜上表面，37 ℃風干4～5h。無血清培養(yǎng)液37 ℃水化基底膜30 min。消化收集0、12.5、25.0、50.0μmol／L 的熊果酸處理48h 的Hep-2細胞，用無血清培養(yǎng)基洗3次并制備單細胞懸液，調(diào)整細胞濃度5×105／mL。Transwell小室上室加入200μL 細胞懸液；小室下室加入500μL 含10%血清培養(yǎng)基培養(yǎng)24h后。棄去培養(yǎng)基并用棉簽擦去底部內(nèi)面未穿過細胞，95%乙醇固定后結晶紫染色，封片。高倍鏡下計數(shù)穿越細胞數(shù)，計算平均數(shù)。

1.2.4 Western blot檢測熊果酸對Hep-2細胞NF-κB蛋白表達的影響 消化收集對數(shù)生長期細胞接種于6孔板上培養(yǎng)至細胞間接近融合，熊果酸終濃度為0、12.5、25.0、50.0μmol／L的培養(yǎng)基作用24h提取細胞總蛋白?？偟鞍诐舛冉?jīng)Bio-Rad測定后經(jīng)SDS-PAGE 凝膠電泳，然后轉移至PVDF 膜上。封閉后與加稀釋一抗抗體（靶蛋白抗體）4 ℃過夜。經(jīng)TBST 漂洗后加入稀釋的二抗室溫孵育2h后熒光顯色，曝光、顯影和定影。掃描蛋白印跡膠片進行吸光度掃描分析，計算各組細胞靶蛋白相對表達量。

1.2.5 明膠酶譜檢測熊果酸對Hep-2細胞MMP-2和MMP-9活性的影響 取對數(shù)生長期Hep-2細胞接種于6孔板培養(yǎng)24h。棄舊培養(yǎng)基并以PBS洗3次。分別加入熊果酸終濃度為0、12.5、25.0、50.0μmol／L 的無血清RPMI-1640培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)24h。收集各組細胞培養(yǎng)上清液，2 000r／min 4℃離心10min。計細胞數(shù)后按照細胞數(shù)取相應體積的上清與等體積的上樣緩沖液混合，在含0.1%明膠的分離膠中進行常規(guī)SDSPAGE電泳。電泳結束后凝膠蒸餾水漂洗數(shù)次，洗脫液搖動洗滌后再次蒸餾水漂洗，明膠緩沖液37 ℃孵育18h后蒸餾水漂洗30min，5g／L考馬斯亮藍G-250染色液染色3h，脫色液處理1～2h，凝膠成像系統(tǒng)觀察、拍照并保存。

1.3 統(tǒng)計學處理 采用SAS6.12和SPSS13.0統(tǒng)計軟件進行分析，計量資料用±s表示，檢驗水準為α＝0.05，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結 果

2.1 熊果酸抑制Hep-2細胞的增殖 熊果酸對Hep-2細胞增殖有顯著的生長抑制作用，不同濃度組間、不同時間組間生長抑制率均差異有統(tǒng)計學意義（F＝13.05，P＜0.01），見圖1。

圖1 熊果酸對Hep-2細胞增殖能力的影響（×200）

2.2 熊果酸抑制Hep-2 細胞的侵襲能力 Hep-2 細胞經(jīng)12.5、25.0、50.0μmol／L 濃度熊果酸作用24h后侵襲能力分別降至72.35±9.99、59.46±8.18、43.75±11.24，與對照組的83.07±13.61 比較，差異有統(tǒng)計學意義（F＝7.212，P＜0.05）。見圖2。

圖2 熊果酸對Hep-2細胞侵襲能力的影響（×200）

2.3 熊果酸抑制Hep-2細胞NF-κB 蛋白的表達 經(jīng)12.5、25.0、50.0μmol／L 的熊果酸作用24h后Hep-2細胞NF-κB蛋白表達明顯降低，分別 降低至0.511±0.160、0.319±0.116、0.153±0.134，與對照組的0.637±0.123比較，差異有統(tǒng)計學意義（F＝7.509，P＜0.05）。見圖3。

圖3 熊果酸對Hep-2細胞NF-κB蛋白表達的影響

2.4 熊果酸抑制Hep-2 細胞MMP-9 和MMP-2 的活性 Hep-2細胞經(jīng)12.5、25.0、50.0μmol／L 濃度的熊果酸作用24 h后MMP-9活性明顯下降，分別降至3 501.174±599.465、2 414.981±550.453、1 267.656±507.451，與 對 照 組 的4 321.349±693.977 比較，差異有統(tǒng)計學意義（F＝15.068，P＜0.01）；MMP-2 活性明顯下 降，分別降至2 636.066±547.143、2 053.827±659.039、1 302.781±481.484，與對照組的3 288.831±581.703比較，差異有統(tǒng)計學意義（F＝6.578，P＜0.05）。見圖4。

圖4 熊果酸對Hep-2細胞MMP-9和MMP-2的影響

3 討 論

熊果酸是一個中藥抗癌活性化合物之一，在水果、蔬菜和藥材等均有發(fā)現(xiàn)，廣泛存在于多種植物的漿果、葉、花和果實內(nèi)，具有抗炎、抗菌、抗氧化劑、抗?jié)?、抗增殖、抗癌、抗誘變、抗動脈粥樣硬化、抗高血壓等多種生化和藥理作用特性［5-7］。幾年來隨著體外實驗及體外動物實驗研究的深入，證實熊果酸可以抑制人肝癌、肺癌、乳腺癌等多種腫瘤細胞的增殖、侵襲和轉移及誘導細胞凋亡且對機體的不良反應少，呈現(xiàn)出良好地臨床應用前景［8-10］。本實驗MTT 結果顯示，熊果酸對人喉癌Hep-2細胞具有濃度和時間依賴性生長抑制作用，能有效地抑制Hep-2細胞增殖的作用。

浸潤和轉移是惡性腫瘤細胞的惡性生物學行為之一，腫瘤細胞對周圍重要組織和重要臟器的侵襲和轉移是惡性腫瘤的主要致死原因之一，是臨床影響惡性腫瘤預后的關鍵因素，因而研究腫瘤細胞侵襲與轉移的機制及防治措施是目前腫瘤診治研究的熱點［11］。喉癌患者尤其是中、晚的侵襲和轉移嚴重影響著患者的生存率和生命質(zhì)量，抑制喉癌的侵襲和轉移也是抗腫瘤藥物的研究重點之一［12］。本研究觀察熊果酸對人喉癌Hep-2細胞侵襲和轉移能力的影響，結果發(fā)現(xiàn)熊果酸能呈濃度效應關系抑制喉癌Hep-2細胞對重組基底膜的侵襲能力。

腫瘤細胞的浸潤和轉移是多步驟、多階段的復雜生物學過程，包括腫瘤細胞穿過細胞外基質(zhì)屏障和血管的基底膜及穿出血管壁并發(fā)生遠處轉移，在這個過程中細胞外基質(zhì)和基底膜的酶解是關鍵的一步。研究表明降解細胞外基質(zhì)和基底膜的重要蛋白酶就是基質(zhì)金屬蛋白酶類（MMPs），它能夠促進腫瘤的浸潤和轉移且與新生血管的形成密切相關。Ⅳ型膠原是生物體內(nèi)構成基底膜的主要成分，MMPs中的MMP-2和MMP-9是Ⅳ型膠原的主要降解酶類，很多研究都表明MMP-2、MMP-9高表達于喉癌組織中，并在喉癌的發(fā)生、發(fā)展、侵襲和轉移中起著重要的作用。當抑制了喉癌Hep-2 細胞中MMP-2、MMP-9基因的表達后就可以顯著抑制Hep-2細胞的侵襲能力［13-14］。本研究結果發(fā)現(xiàn)熊果酸呈濃度依賴性下調(diào)MMP-2和MMP-9的活性。

NF-κB是一類具有多向轉錄調(diào)節(jié)作用的核轉錄因子，廣泛存在于生物體內(nèi)多種組織細胞中，具有廣泛的生物學活性。NF-κB可被多種因素激活，能與多種免疫和炎癥反應有關的基因的啟動子和增強子中序列位點發(fā)生特異性結合并促進轉錄和表達，參與感染、炎癥反應、氧化應激、胚胎發(fā)生、細胞增生、細胞凋亡等眾多生理病理過程。近年來的大量研究表明NFκB與多種腫瘤的發(fā)生、發(fā)展和浸潤轉移及腫瘤耐藥問題密切相關［15-16］。本研究結果發(fā)現(xiàn)熊果酸呈濃度依賴性下調(diào)NF-κB蛋白的表達。

綜上所述，熊果酸可通過下調(diào)MMP-2和MMP-9基因的活性及NF-κB蛋白表達抑制喉癌Hep-2細胞的增殖和侵襲能力，其可能是熊果酸抗腫瘤作用的一重要途徑。為熊果酸用于喉癌的治療提供了有效的理論基礎，但其具體抗腫瘤機制和確切療效仍需要進一步實驗研究。

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