徐 敏

（安順職業(yè)技術(shù)學(xué)院應(yīng)用醫(yī)藥系，貴州安順561000）

沙棘總黃酮是胡頹子科沙棘屬沙棘的主要活性成分。沙棘別名醋柳、酸柳果，為落葉性小喬木或灌木［1-4］。沙棘在我國(guó)資源豐富，尤其是食用和藥用價(jià)值世界公認(rèn)，因此合理開(kāi)發(fā)沙棘資源，提高沙棘資源的附加值具有重要的意義［5］。沙棘的生態(tài)價(jià)值、營(yíng)養(yǎng)價(jià)值和藥用價(jià)值都很高。沙棘是具有枝葉茂密、根系發(fā)達(dá)、生長(zhǎng)迅速、抗干旱、御嚴(yán)寒、保持水土、防風(fēng)固沙、改良土壤、適應(yīng)性強(qiáng)等特點(diǎn)的優(yōu)質(zhì)植物，其內(nèi)含有蛋白質(zhì)、糖類、脂類、維生素等多種營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)。另外，沙棘因富含多種生物活性成分尤其是沙棘中的黃酮類化合物具有重要的藥用價(jià)值。沙棘總黃酮在心血管、消化、呼吸、抗腫瘤、抗衰老、提高機(jī)體免疫力等多方面具有治療優(yōu)勢(shì)，具有活血、養(yǎng)胃、健脾、利肺、祛痰等藥理功效，在臨床上有著廣泛前景及應(yīng)用價(jià)值，并記載在古代的《月王藥珍》、《四部醫(yī)典》和《晶珠本草》等醫(yī)書(shū)中［6-7］。沙棘總黃酮還可吸收紫外線，有直接捕獲超氧自由基和羥基自由基的作用，對(duì)皮膚系統(tǒng)具有清除自由基、抗氧化、抗輻射、抗衰老的作用［8-9］。本實(shí)驗(yàn)采用從一次利用后的高原沙棘果渣和籽渣中提取黃酮，通過(guò)對(duì)小鼠中波紫外線（UVB）輻射皮膚損傷模型的影響，初探其抗紫外線輻射的作用，以便為深度開(kāi)發(fā)和綜合利用沙棘資源提供參考。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物 KM 小鼠，雌性，42～56d，體質(zhì)量22～25g，購(gòu)自貴陽(yáng)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，按清潔動(dòng)物標(biāo)準(zhǔn)條件分籠喂養(yǎng)。

1.2 藥品及試劑 1%沙棘總黃酮提取物自制藥物；高原護(hù)膚霜由第二軍醫(yī)大學(xué)藥學(xué)院研制生產(chǎn)；6%硫化鈉，成都化學(xué)試劑廠；1%戊巴比妥鈉，北京普博斯生物科技有限公司；羥脯氨酸標(biāo)準(zhǔn)品由中國(guó)藥品生物制品檢定所提供；考馬斯亮藍(lán)蛋白測(cè)試、超氧化物歧化酶（SOD）測(cè)試盒、丙二醛（MDA）測(cè)試盒均是南京建成生物工程研究所產(chǎn)品。

1.3 方法

1.3.1 沙棘總黃酮的提取 沙棘除汁，晾干，用中藥粉碎機(jī)粉碎，60℃烘干12h，用超臨界CO2萃取裝置去油。稱取去油粉末100g，用超聲波以5倍體積的純水萃取1h，過(guò)濾得濾液Ⅰ；濾渣重復(fù)萃取，過(guò)濾得濾液Ⅱ；合并濾液Ⅰ、Ⅱ。60 ℃以下減壓蒸餾濃縮，然后加95%乙醇至60%醇沉，放置低溫過(guò)夜。過(guò)濾溶液，4 000r／min離心，取液體減壓蒸餾，回收乙醇，濃縮液體。冷凍干燥得20mg干粉，所得干粉即沙棘總黃酮給藥組的主要成分。

1.3.2 UVB輻射小鼠皮膚損傷模型的構(gòu)建、分組設(shè)計(jì)、給藥途徑［10-14］小鼠注射1%戊巴比妥鈉進(jìn)行麻醉，并把小鼠背部鼠毛剪短至1 mm，用配制好6%Na2S 液體脫掉面積約為5cm×5cm 的鼠毛。將已脫毛的小鼠分為4 組，每組10 只：正常對(duì)照組（正常組）﹑UVB照射組（模型組）﹑UVB照射＋高原護(hù)膚霜（陽(yáng)性對(duì)照組）﹑ UVB照射＋1%沙棘總黃酮給藥組（沙棘總黃酮給藥組）。給予普通基礎(chǔ)顆粒飼料，每日1次。正常組不做UVB照射，模型組只做UVB 照射。陽(yáng)性對(duì)照組和沙棘總黃酮給藥組的小鼠用戊巴比妥鈉麻醉后，皆為均勻的一層覆蓋涂抹給藥，10min后與模型組一起置于40w 紫外光源下（光源距小鼠皮膚垂直距離為35cm）UVB 輻射20 min（輻照強(qiáng)度為0.17mW／cm2，放射270～400nm 連續(xù)波譜，光譜集中在313nm）。持續(xù)相同時(shí)間輻射7d，第7天輻射結(jié)束后24h內(nèi)，把小鼠背部脫毛區(qū)的皮膚取下，然后去除血液和皮下脂肪，并用生理鹽水漂洗，最后固定和冷凍保存以備用。

1.3.3 制作病理切片 將取材的部分皮膚組織，放入固定液（10%福爾馬林溶液）固定，石蠟包埋，用切片機(jī)切成薄片，一般為厚為4μm，用蘇木精-伊紅（HE）染色法染色，顯微鏡下觀察病理變化。

1.3.4 制備皮膚組織勻漿 用濾紙將取材的部分皮膚組織拭干稱取組織質(zhì)量，加9倍的組織質(zhì)量的預(yù)冷的勻漿介質(zhì)放在冰上，并將組織充分剪碎進(jìn)行勻漿，在冰浴中多次研磨以研碎皮膚組織，勻漿后皮膚組織用低溫高速離心機(jī)4 000r／min離心15min，取適量上清液待測(cè)。組織勻漿上清液中蛋白含量的測(cè)定采用考馬斯亮藍(lán)法（Bradford法）檢測(cè)，以牛血清清蛋白為標(biāo)準(zhǔn)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.3.5 SOD 活性的測(cè)定 SOD 活性的測(cè)定采用黃嘌呤氧化酶法，具體測(cè)定按測(cè)試盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。

1.3.6 MDA 量的測(cè)定MDA量的測(cè)定采用TBA法，具體測(cè)定按測(cè)試盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。

1.3.7 膠原蛋白量的測(cè)定 膠原蛋白中的羥脯氨酸占其總氨基酸的13.4%［15］，分析其中羥脯氨酸的含量，可換算出膠原蛋白的量［16］。羥脯氨酸含量的測(cè)定用氯胺-T 法：即氯胺-T 作為氧化劑能把羥脯氨酸氧化，再用高氯酸終止氧化，最后加入對(duì)二甲氨基苯甲醛溶液生成紫紅色化合物進(jìn)行比色測(cè)定；然后取不同量的羥脯氨酸標(biāo)準(zhǔn)品制作標(biāo)準(zhǔn)曲線；最后根據(jù)膠原蛋白量＝羥脯氨酸測(cè)定濃度／組織質(zhì)量／0.134，計(jì)算出膠原蛋白的量。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS12.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析處理，計(jì)量資料以±s表示，組間比較采用方差分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 實(shí)驗(yàn)期間小鼠的皮膚形態(tài)學(xué)觀察 正常組小鼠皮膚各層細(xì)胞紋理清晰，有較薄的真皮層，有排列有序的波浪狀彈性纖維，未見(jiàn)盤(pán)曲打結(jié)、聚集成團(tuán)的現(xiàn)象，有束狀定向疏松排列的膠原纖維，皮膚附屬器完整。模型組小鼠皮膚有層次增加的表皮細(xì)胞，有增厚的真皮層，有呈嗜堿性變、無(wú)定形、破壞、變粗、盤(pán)曲打結(jié)、聚集成團(tuán)、甚至消失的彈性纖維，有不規(guī)則排列、粗大致密的膠原纖維，皮膚附屬器缺失。陽(yáng)性對(duì)照組小鼠皮膚有呈結(jié)節(jié)狀或旋渦狀不規(guī)則排列、粗大致密的膠原纖維。沙棘總黃酮給藥組小鼠皮膚和模型組相比，表皮及其附屬器較完整，真皮層中彈性纖維破壞較小，有排列較規(guī)則的膠原纖維。見(jiàn)圖1。

圖1 各組小鼠皮膚組織HE染色（×100）

表1 UVB輻射后小鼠皮膚組織SOD、MDA 和膠原 蛋白含量變化（±s，n＝10）

表1 UVB輻射后小鼠皮膚組織SOD、MDA 和膠原 蛋白含量變化（±s，n＝10）

＃：P＜0.01，＊：P＜0.05，與正常組比較；△：P＜0.01，與模型組比較。

組別 SOD（U／mg） MDA（nmol／mg） 膠原蛋白含量（μg／mg）正常組84.25±7.87 1.82±0.33 1.26±0.10模型組 61.17±3.59＃ 3.19±0.45＃ 1.01±0.09＊陽(yáng)性對(duì)照組 75.10±6.27△ 1.63±0.26△ 1.79±0.15△沙棘總黃酮給藥組 72.41±4.05△ 1.45±0.30△ 1.38±0.14△

2.2 小鼠皮膚組織SOD 活性測(cè)定結(jié)果 模型組小鼠經(jīng)UVB輻射后，與正常組相比，皮膚組織中的SOD 活性極顯著降低（P＜0.01）；與模型組相比，陽(yáng)性對(duì)照組和沙棘總黃酮給藥組SOD 的活性極顯著升高（P＜0.01）。見(jiàn)表1。

2.3 小鼠皮膚組織MDA 量的檢測(cè)結(jié)果 與正常組比較，模型組含MDA 的量多（P＜0.01）；與模型組比較，陽(yáng)性對(duì)照組和沙棘總黃酮給藥組含MDA 的量少（P＜0.01）。見(jiàn)表1。

2.4 小鼠皮膚組織膠原蛋白量的測(cè)定結(jié)果 與正常組比較，模型組小鼠膠原蛋白的量降低（P＜0.05）；與模型組比較，陽(yáng)性對(duì)照組和沙棘總黃酮給藥組較高（P＜0.01），而陽(yáng)性對(duì)照組產(chǎn)生了增生性瘢痕。

3 討 論

本實(shí)驗(yàn)選7dUVB輻射小鼠，展示UVB累加損傷皮膚的過(guò)程，客觀具體地模擬了生活中UVB對(duì)皮膚的損害。紫外線根據(jù)波段可分為長(zhǎng)波紫外線 （UVA）、UVB、短波紫外線（UVC）。大量資料顯示，UVB 是預(yù)防皮膚光老化的重點(diǎn)［14］。所以，本實(shí)驗(yàn)選擇UVB為主要波段的光源。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)UVB輻射小鼠來(lái)構(gòu)建皮膚損傷模型，并把小鼠背部脫毛區(qū)的皮膚取下做組織病理切片，進(jìn)行病理學(xué)觀察。模型組小鼠皮膚形態(tài)學(xué)變化明顯，表皮細(xì)胞層增加，真皮層增厚，說(shuō)明成功造模，同時(shí)也驗(yàn)證了長(zhǎng)時(shí)間UVB 輻射可誘導(dǎo)皮膚的老化。紫外線引起的效應(yīng)不是單個(gè)因素，而是多個(gè)因素的綜合。紫外線輻射，自由基增多，使構(gòu)成細(xì)胞組織的糖類、脂類、蛋白質(zhì)等大分子物質(zhì)被氧化而受損，從而破壞細(xì)胞的結(jié)構(gòu)和功能、組織構(gòu)成，導(dǎo)致器官老化及病變。其中構(gòu)成生物膜脂類成分中的多不飽和脂肪酸由于化學(xué)性質(zhì)活躍，容易被自由基破壞而形成MDA 等脂類過(guò)氧化物。因此，MDA 的量是皮膚內(nèi)脂類受過(guò)氧化損傷程度的標(biāo)志，間接地反映出氧自由基的含量及細(xì)胞受損傷的程度［16］。本實(shí)驗(yàn)中檢測(cè)MDA 的量，模型組比正常組極顯著增高，沙棘總黃酮給藥組比模型組極顯著降低，說(shuō)明沙棘總黃酮在防紫外線抗氧化的作用中效果好。SOD 是人體不可缺少的一類重要的清除氧自由基的生物活性蛋白質(zhì)，起到抗衰老作用，即催化并消除超氧陰離子，在維護(hù)體內(nèi)自由基產(chǎn)生和清除的平衡中起著重要作用，故SOD 活性已成為抗衰老的重要指標(biāo)［8］。本實(shí)驗(yàn)中，沙棘總黃酮給藥組SOD 的活性極顯著升高，說(shuō)明沙棘總黃酮可提高SOD 的活性，減少皮膚損傷，為今后阻止和解決UVB輻射誘導(dǎo)的皮膚老化問(wèn)題提供了支撐。

人體中含量最豐富的膠原蛋白在皮膚組成成分中占有主導(dǎo)地位，可使皮膚維持張力和承受外界拉力，增加皮膚彈性和韌性，使皮膚充盈和豐滿。膠原蛋白是惟一含羥脯氨酸較多的蛋白質(zhì)，因此，測(cè)定膠原蛋白的量可通過(guò)羥脯氨酸的量來(lái)確定。本實(shí)驗(yàn)的檢測(cè)結(jié)果表明，沙棘總黃酮給藥組膠原蛋白的量比模型組極顯著的升高，說(shuō)明沙棘總黃酮對(duì)皮膚中膠原的合成和分泌具有促進(jìn)作用。陽(yáng)性對(duì)照組膠原蛋白的量最高，并產(chǎn)生了增生性瘢痕。增生性瘢痕與膠原的代謝失平衡有關(guān)，瘢痕組織中膠原合成和降解都增加，但膠原合成超過(guò)降解，使其過(guò)度沉著，由此產(chǎn)生了瘢痕增生。

總之，沙棘總黃酮可防止氧化損傷，增強(qiáng)膠原蛋白的合成和分泌，抑制瘢痕增生，從而為其用于防紫外線損傷提供了有利的證據(jù)，但沙棘總黃酮用于防紫外線損傷的機(jī)制還需要進(jìn)一步研究與探索。

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