鄒紅梅，汪莉娜，段但永豪，魏學(xué)良，王鮮忠（西南大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院重慶市牧草與草食家畜重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，重慶北碚400715）

鉛和鎘聯(lián)合染毒對(duì)雄性大鼠生殖功能的影響

鄒紅梅，汪莉娜，段但永豪，魏學(xué)良，王鮮忠
（西南大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院重慶市牧草與草食家畜重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，重慶北碚400715）

摘要：將24只雄性SD大鼠（體重130±5 g）隨機(jī)分成對(duì)照組、鉛處理組、鎘處理組和鉛鎘聯(lián)合處理組。結(jié)果聯(lián)合染毒組降低了日增重；增加了睪丸體重比、腎臟體重比，其作用介于單獨(dú)作用之間，但肝臟體重比高于單獨(dú)作用組。聯(lián)合染毒組中血清T-SOD和谷胱甘肽過(guò)氧化物酶（GSH-Px）顯著增加（P<0.05）、ALT、CREA的水平顯著降低（P<0.05），AST、LDH、ALP的水平有所降低（P>0.05)。聯(lián)合作用使睪丸勻漿中TNOS、iNOS、T-SOD和丙二醛（MDA）水平顯著升高（P< 0.05），睪丸抑制羥自由基能力顯著降低（P<0.05）、睪丸勻漿中GSH-Px的活力有所降低（P>0.05），其作用介于單獨(dú)作用之間。聯(lián)合染毒組降低大鼠精子總數(shù)、頂體完整率（P<0.05），但增加了畸形率（P<0.05），其作用介于單組染毒組之間。鉛鎘聯(lián)合處理組作用對(duì)大鼠生殖功能有拮抗效應(yīng)。

關(guān)鍵詞：鉛；鎘；聯(lián)合；大鼠；生殖功能

Corresponding author：WANG Xian-zhong

鉛單獨(dú)作用不僅會(huì)導(dǎo)致精液質(zhì)量下降和性欲降低，而且會(huì)引起睪丸的退行性變化，并使精子軸絲濃縮、變性，直接使其精子活力降低[1]。鎘單獨(dú)作用也可以誘導(dǎo)睪丸、附睪等組織器官發(fā)生結(jié)構(gòu)和功能上的退行性變化，引起生精障礙甚至不育；鎘注射后，附睪、精囊、前列腺體積縮小和重量減輕，能夠使精子數(shù)、精子密度及其精子活動(dòng)率下降，抑制離體睪丸支持細(xì)胞分泌睪丸酮。以往的研究主要是研究?jī)煞N重金屬的單獨(dú)作用，但是兩種金屬在自然界是同時(shí)存在的，而且金屬之間多具有伴生性，鉛和鎘在自然界中常形成復(fù)合污染。然而鉛和鎘的聯(lián)合生殖毒性還未見(jiàn)報(bào)道。為了研究?jī)煞N重金屬的聯(lián)合生殖毒性，本試驗(yàn)以雄性大鼠（體重130±5 g）為研究對(duì)象，通過(guò)長(zhǎng)期灌喂試驗(yàn)，旨在探究鉛和鎘聯(lián)合作用對(duì)雄性生殖功能的影響及可能的作用機(jī)制。

1　材料與方法

1.1材料醋酸鉛[Pb（CH3COO）2）]、氯化鎘（CdCl2），購(gòu)自Sigma公司；SPF級(jí)昆明系雄性大鼠（體重130± 5 g，由重慶中藥研究所提供）；各種檢測(cè)試劑盒，均購(gòu)自南京建成生化試劑有限公司，其他試劑為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2方法

1.2.1大鼠飼喂試驗(yàn)將24只SPF級(jí)昆明系雄性大鼠（體重130±5 g）隨機(jī)分成4組，每組6只，分別是對(duì)照組；300 mg Pb（CH3COO）2/L組；50 mg CdCl2/L組；300 mg Pb（CH3COO）2/L+50 mg CdCl2/L組。對(duì)照組自由飲用超純水，染毒組自由飲用配制毒液。大鼠飼養(yǎng)于標(biāo)準(zhǔn)化的實(shí)驗(yàn)室，保證恒溫（22℃）和恒定的光照周期。每天定時(shí)飼喂，自由采食顆粒飼料和飲水，定時(shí)更換墊料，隨時(shí)觀察大鼠的臨床癥狀，第36天對(duì)全部大鼠進(jìn)行麻醉后脫頸處死。

1.2.2鉛鎘聯(lián)合染毒對(duì)大鼠生長(zhǎng)發(fā)育的影響在染毒飼喂期間，每1周測(cè)1次大鼠的體重。在染毒結(jié)束后，首先稱(chēng)量大鼠的重量，然后稱(chēng)取內(nèi)臟的重量，并計(jì)算肝臟、腎臟和睪丸指數(shù)。

1.2.3鉛鎘聯(lián)合染毒對(duì)肝腎功能的影響采用眼球摘除法收集血樣，使用血液生化分析儀檢測(cè)肝腎功能的指標(biāo)，丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶、天門(mén)冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶、肌酐、乳酸脫氫酶、堿性磷酸酶，測(cè)定方法參考Zhang[2]所使用的方法，以確定對(duì)肝腎功能的影響。

1.2.4鉛鎘聯(lián)合染毒對(duì)精液品質(zhì)和大鼠睪丸抗氧化能力的影響根據(jù)實(shí)驗(yàn)室建立的方法收集精液并進(jìn)行精液品質(zhì)簽定，具體見(jiàn)zhang[2]。4℃條件下，將采集的睪丸樣本加入5 mL用冰預(yù)冷的Tris-HCL buffer溶液（0.01 mol/L，pH值7.4），13 000 r/min離心2 min后，組織勻漿液浮于上層，將上層液體吸出保存，各種生化指標(biāo)測(cè)定的具體操作按說(shuō)明書(shū)和相關(guān)文獻(xiàn)[3]進(jìn)行。

1.3統(tǒng)計(jì)分析每個(gè)試驗(yàn)重復(fù)2-3次，所獲得的試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS16.0軟件分析數(shù)據(jù)間差異的顯著性（P<0.05）；并采用one-way ANOVAs分析各組處理間的相關(guān)性，所有百分?jǐn)?shù)在正弦轉(zhuǎn)化后再進(jìn)行分析，經(jīng)由LSD法分析不同組間的差異，表中不同的字母表示差異顯著。

2　試驗(yàn)結(jié)果

2.1鉛鎘聯(lián)合染毒對(duì)大鼠體重、肝臟和腎臟重量、睪丸重量的影響從表1可以看出，各種處理對(duì)體重的影響不顯著（P>0.05）。Pb單獨(dú)作用時(shí)降低了肝臟重體重比（P>0.05），增加了腎臟重體重比和睪丸重體重比（P<0.05）；Cd組單獨(dú)作用時(shí)降低了肝臟重體重比（P<0.05）、腎臟體重比（P>0.05）和睪丸重體重比（P>0.05）。聯(lián)合染毒組與對(duì)照組相比增加了肝臟體重比（P<0.05），其作用強(qiáng)于單獨(dú)作用組；聯(lián)合作用也降低了腎臟重體重比（P<0.05）和睪丸重體重比（P>0.05），其作用強(qiáng)度介于Pb和Cd單獨(dú)作用之間。

表1　鉛和/或鎘對(duì)大鼠體重和臟器指數(shù)的影響　[X（平均數(shù)）±SE（標(biāo)準(zhǔn)誤）（n=6）]

2.2鉛鎘聯(lián)合染毒對(duì)血清生化指標(biāo)的影響Pb、Cd單獨(dú)作用對(duì)于血清中丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（ALT）的水平無(wú)顯著影響（P>0.05），但卻顯著增加了天門(mén)冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（AST）的水平（P<0.05）。聯(lián)合染毒顯著降低了ALT的水平，與對(duì)照相比降低37.61%（P< 0.05）；但對(duì)于天門(mén)冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（AST）的水平?jīng)]有顯著影響（P>0.05）。Pb、Cd單獨(dú)作用也顯著增加了肌酐（CREA）的水平（P<0.05），而聯(lián)合染毒組其肌酐（CREA）水平較Pb組、Cd組偏低，僅為Pb組的76.28%、Cd組的95.61%。Pb組、Cd組單獨(dú)作用也顯著增加了堿性磷酸酶（ALP）的水平（P<0.05），而聯(lián)合染毒組ALP的水平與對(duì)照組相比差異不顯著（P> 0.05）（表2）。Pb顯著影響了乳酸脫氫酶（LDH）的水平（P<0.05），而Cd的作用弱于Pb，二者聯(lián)合作用時(shí)LDH低于單獨(dú)作用時(shí)的水平（表2）。此外，與對(duì)照組相比，鉛鎘單獨(dú)或者聯(lián)合染毒使大鼠血清中TSOD和GSH-Px的含量有顯著變化（見(jiàn)表2）。

2.3鉛鎘聯(lián)合染毒對(duì)大鼠精液品質(zhì)的影響從表3可以發(fā)現(xiàn)，與對(duì)照組相比，Pb、Cd無(wú)論是單獨(dú)還是聯(lián)合作用均顯著降低了精子總數(shù)（P<0.05），增加了精子畸形率（P<0.05），聯(lián)合作用組的效果介于二者之間。此外，Cd組、聯(lián)合染毒組顯著降低了頂體完整率（P<0.05），Pb組較對(duì)照組有所降低（P>0.05）。

表2　鉛和/或鎘對(duì)大鼠肝臟、腎臟指標(biāo)的影響　[X（平均數(shù)）±SE（標(biāo)準(zhǔn)誤）（n=6）]

表3　鉛和/或鎘對(duì)大鼠精子數(shù)量和特性的影響[X（平均數(shù)）±SE（標(biāo)準(zhǔn)誤）（n=6）]

2.4鉛鎘聯(lián)合染毒對(duì)氧化應(yīng)激相關(guān)分子的影響鉛、鎘單獨(dú)染毒均影響了睪丸組織中iNOS、MDA的水平，而且聯(lián)合染毒組的作用更顯著（P<0.05）。與對(duì)照組相比，鉛、鎘單獨(dú)染毒組和聯(lián)合染毒組都顯著增加了iNOS的濃度（P<0.05），但聯(lián)合染毒組與Pb組差異顯著（P<0.05）。鉛鎘單獨(dú)染毒組和聯(lián)合染毒組都顯著降低了睪丸抑制羥自由基能力（P< 0.05），分別降低了26.43%、28.85%、48.39%，但聯(lián)合染毒組比單獨(dú)染毒組作用更顯著（P<0.05）。此外，鉛鎘單獨(dú)或聯(lián)合染毒使大鼠睪丸抗氧化酶T-SOD活性與非酶性抗氧化劑GSH含量均有顯著變化（P< 0.05）（見(jiàn)表4）。

表4　鉛和/或鎘對(duì)大鼠氧化應(yīng)激相關(guān)分子的影響　[X（平均數(shù)）±SE（標(biāo)準(zhǔn)誤）（n=6）]

3　討論

王林研究發(fā)現(xiàn)，鉛鎘聯(lián)合作用對(duì)腎臟具有協(xié)同作用[4]。但本試驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，鉛鎘聯(lián)合染毒組對(duì)雄性大鼠生殖功能的影響并不具有伴生性，出現(xiàn)差異可能與使用動(dòng)物的年齡有關(guān)[4]，也可能與鉛鎘聯(lián)合作用對(duì)不同器官的敏感性并不相同有關(guān)。

本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，鉛鎘單獨(dú)染毒組使血清中ALT、AST、LDH、ALP、CREA的水平明顯升高，這表明鉛鎘對(duì)肝腎功能有明顯的毒害作用，但是聯(lián)合作用時(shí)這些指標(biāo)卻沒(méi)有表現(xiàn)出疊加效應(yīng)，與王林的結(jié)果不一致[4]，這可能是因?yàn)殒k在不同年齡階段誘導(dǎo)金屬硫蛋白表達(dá)水平的差異導(dǎo)致鉛鎘聯(lián)合作用對(duì)肝臟功能產(chǎn)生不同作用的結(jié)果。本試驗(yàn)中鉛鎘單獨(dú)染毒降低了睪丸中GSH和GSH-Px的活力，這與鉛鎘單獨(dú)作用對(duì)睪丸組織抗氧化酶活性的影響相一致[4，6]，但二者聯(lián)合作用并不能使這些參數(shù)發(fā)生疊加效應(yīng)，這可能是因?yàn)殒k主要通過(guò)引起細(xì)胞膜的脂質(zhì)發(fā)生過(guò)氧化，降低細(xì)胞內(nèi)抗氧化劑水平和通過(guò)介導(dǎo)線粒體功能損傷來(lái)增加活性氧的產(chǎn)生[5]；而鉛則主要通過(guò)改變膜脂質(zhì)成分改變會(huì)引起膜完整性破壞、通透性和流動(dòng)性降低，使細(xì)胞膜更易發(fā)生脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)。鎘誘導(dǎo)睪丸中金屬硫蛋白的表達(dá)，使鉛的毒性作用不能充分發(fā)揮，因此出現(xiàn)相互拮抗的現(xiàn)象。特別需要指出的是，盡管鉛鎘聯(lián)合染毒有一定的拮抗作用，但仍有較強(qiáng)的損害作用，因此，其毒害作用仍不可忽視。

參考文獻(xiàn)：

[1]韓磊，張恒東.鉛、鎘的毒性及其危害[J].職業(yè)衛(wèi)生與病傷，2009，24（3）：173-177.

[2] Jiao- jiao Zhang，Yi Wang，Hai- yang Xiang，et al . Oxidative stress：role in acetamiprid-induced impairment of the male mice reproductive system[J] . Agricultural Sciences in China . 2011，10 （5）：786-796.

[3] Wang X Z，Liu S S，Sun Y . et al . Beta-cypermethrin impairs re?productive function in male mice by inducing oxidative stress[J] . Theriogenology，2009，72（5）：599-611.

[4]王林.鉛鎘聯(lián)合對(duì)大鼠腎臟的毒性研究[D].揚(yáng)州：揚(yáng)州大學(xué)，2009.

[5] Joseph P . Mechanisms of cadmium carcinogenesis [J] . Toxicology and Applied Pharmacology，2009，238（3）：272-279.

[6] Veena Sharma，Leena Kansal，Arti Shanna.Prophylactic Efficacy of Coriandrum sativum（Coriander）on Testis of Lead-Exposed Mice[J]. Biological Trace Element Research，2010，136（3）：337-354.

Combined Effects Of Lead And Cadmium On Reproductive Function In Male Rats

ZOU Hong-mei，WANG Li-na，DUAN DAN Yong-hao，WEI Xue-liang，WANG Xian-zhong
（Chongqing Key Laboratory of Forage & Herbivorce，College of Animal Science，Veterinary and Aquaculture，Southwest University，Chongqing 400716，China）

Abstract：Twenty-four SD male rats（125～135 g）were randomly divided into four groups（n=6 per group）.Rat daily gain of the combined exposure group was significantly decreased.However，testis weight ratio and kidney weight ratio of the combined exposure group was significantly increased，which were more than those of the Pb exposure group，but less than those of the Cd exposure group. And liver weight ratio of the combined exposure group was the highest.In addition，SOD and GSH-PX in serum of the combined exposure group was significantly increased（P<0.05）；the level of ALT and CRE was significantly decreased（P<0.05），while the level of AST，LDH，and ALP was decreased slightly（P>0.05）.In the combined exposure group, the level of TNOS，iNOS, T-SOD，and MDA in testis homogenates was significantly increased（P<0.05）；the capacity of inhibiting the hydroxyl radicals in testis was also significantly reduced （P<0.05）.However, the vitality of GSH-PX in testis homogenates was reduced slightly（P> 0.05），ranging between the single exposure groups.The total number of sperm and the proportion of acrosome integrity of combined exposure group was significantly decreased（P< 0.05），but the malformation rate was significantly increased（P<0.05），which ranged between single exposure groups.The combined treatment of lead and cadmium has antagonistic effects on reproductive function in male rats.

Key words:lead；cadmium；combined treatment；rat；reproductive function

通訊作者：王鮮忠，E-mail：xianzhong wang@aliyun.com

作者簡(jiǎn)介：鄒紅梅（1992-），女，本科生，從事動(dòng)物醫(yī)學(xué)專(zhuān)業(yè)學(xué)習(xí)，E-mail：1563624571@qq.com

基金項(xiàng)目：國(guó)家大學(xué)生創(chuàng)新性實(shí)驗(yàn)計(jì)劃項(xiàng)目（20120635009）

收稿日期：2014-03-05

中圖分類(lèi)號(hào)：S865.1+2

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號(hào)：0529- 6005（2015）10- 0074- 03