徐　斌，宋春梅，杜　娟，葛紅娟（吉林醫(yī)藥學(xué)院，吉林吉林132013）

甜蕎總黃酮的體外抗氧化活性研究

徐斌，宋春梅，杜娟，葛紅娟
（吉林醫(yī)藥學(xué)院，吉林吉林132013）

摘要：為了探討甜蕎總黃酮提取物體外抗氧化作用，通過DPPH法、改良Smirnof法和鄰苯三酚自氧化法分別測定甜蕎總黃酮化合物清除DPPH·自由基、羥自由基（·OH）和超氧陰離子自由基（·O2-）的效果。結(jié)果表明，在試驗的濃度范圍內(nèi)，甜蕎總黃酮提取物能有效清除DPPH·自由基及超氧陰離子自由基，且隨著提取物濃度的升高，其自由基清除能力也顯著提高。表明甜蕎總黃酮提取物具有較強的體外抗氧化活性。

關(guān)鍵詞：甜蕎；總黃酮；抗氧化活性

Corresponding author：SONG Chun-mei

蕎麥為蓼科蕎麥屬的雙子葉一年生草本植物，別名烏麥、花麥、三角麥，是世界范圍內(nèi)廣泛種植的經(jīng)濟作物。蕎麥在我國的主產(chǎn)區(qū)包括東北、西北、華北和西南高寒山區(qū)等，甜蕎（common buckwheat，普通蕎麥）和苦蕎（F.Tartaricum L.Gaerth，韃靼蕎麥)是主要的栽培品種[1]。蕎麥味甘，性平寒，《本草綱目》記載：有益氣、續(xù)精神、消熱腫風(fēng)痛、寬腸開胃、磨積滯、脾積泄瀉的作用[2-3]。除藥用價值外，蕎麥還含有豐富的營養(yǎng)成分[4]，包括蛋白質(zhì)，微量元素、維生素等，特別是槲皮素、兒茶素、山奈酚、蘆丁等黃酮類化合物含量較高。研究表明，黃酮類化合物是蕎麥發(fā)揮抗氧化、降血糖、降血脂等功效的主要成分[5]。因苦蕎中黃酮類化合物含量高于甜蕎，以往對蕎麥的研究，多集中于苦蕎有效成分的提取及功效研究，但苦蕎籽粒味苦，種植區(qū)域多集中在西南山區(qū)，口感、產(chǎn)量和普及程度均遠(yuǎn)低于甜蕎，因此，對甜蕎有效成分的研究和保健食品開發(fā)更具經(jīng)濟效益。本試驗采用乙醇回流浸提法提取吉林地區(qū)產(chǎn)甜蕎的黃酮類化合物，并對提取物的體外抗氧化能力進行評價，以期為甜蕎的進一步綜合利用和保健食品的開發(fā)提供理論參考。

1　材料與方法

1.1材料和試劑吉林老爺嶺甜蕎麥，購自吉林市永鵬農(nóng)副產(chǎn)品開發(fā)有限公司，由吉林醫(yī)藥學(xué)院藥學(xué)院馮波教授鑒定；蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品，購自成都普菲德生物技術(shù)有限公司；DPPH標(biāo)準(zhǔn)品，購自Sig?ma公司；抗壞血酸、水楊酸、焦性沒食子酸、鹽酸、Tris、甲醇、乙醚、硝酸鋁、氫氧化鈉、亞硝酸鈉等試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2試驗儀器UV1800紫外-可見分光光度計：日本島津公司；RE-52AA旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀：上海亞榮生化儀器廠；SHB-ⅢA循環(huán)水式多用真空泵：上海豫康科教儀器設(shè)備有限公司；TD5A臺式低溫離心機：湖南凱達科學(xué)儀器有限公司；XW-891漩渦混合器：永嘉華聯(lián)科學(xué)儀器廠；ZN-500A高速中草藥粉碎機：長沙中南制藥機械廠。

1.3試驗方法

1.3.1甜蕎的預(yù)處理蕎麥去雜質(zhì)，中藥粉碎機粉碎后過40目篩，烘箱中65℃干燥至恒重。石油醚脫脂，每次30 mL石油醚過濾3次，待石油醚揮發(fā)盡后，再次置于烘箱中60℃干燥6 h。

1.3.2甜蕎總黃酮的提取蘆丁最大吸收峰的選擇：精密稱取干燥至恒重的蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品5 mg，加入70%乙醇溶解并定容至10 mL，得到濃度為0.5 mg/mL的蘆丁標(biāo)準(zhǔn)儲備液。取蘆丁標(biāo)準(zhǔn)儲備液2 mL，置于10 mL容量瓶中，依次加入顯色劑：5%NaNO20.4 mL，放置6 min；10%Al（NO3）30.4 mL，放置6 min；4%NaOH34.0 mL。30%乙醇定容至刻度，搖勻，以試劑空白為參比，用紫外-可見分光光度計于200～600 nm范圍內(nèi)進行吸光度掃描，2次重復(fù)掃描取平均值，最大特征吸收峰為380 nm。

標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立：分別移取0.0、0.1、0.2、0.4、0.5、0.8、1.0 mL和1.5 mL蘆丁標(biāo)準(zhǔn)儲備液于10 mL的容量瓶中。按照前述方法依次加入顯色劑，30%乙醇定容，以試劑空白為參比，于380 nm處測定其吸光度值（A）。以吸光度（A）為縱坐標(biāo)，蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液的質(zhì)量濃度（mg/mL）為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線并計算相關(guān)系數(shù)R。

總黃酮提?。簻?zhǔn)確稱取3.0 g預(yù)處理后的甜蕎樣品，濾紙包緊后置于索式提取器中，以70%乙醇為溶劑，按照1∶30（g∶mL）的料液比，在85℃水浴下回流提取2 h，過濾，濾液2 500 r/min離心10 min，上清液經(jīng)減壓蒸餾后得甜蕎總黃酮提取物備用。采用亞硝酸鈉-硝酸鋁-氫氧化鈉比色法于380 nm處測定其吸光度值，并計算提取物中總黃酮含量。甜蕎總黃酮含量（mg/g）=[樣品中相當(dāng)于標(biāo)準(zhǔn)蘆丁濃度（mg/mL）×稀釋倍數(shù)×定容體積（mL）]/樣品質(zhì)量（g）。1.3.3 DPPH·自由基清除作用測定取10 mL具塞比色管，各管中分別加入2 mL一定濃度的樣品液（10 μg/mL，20 μg/mL，50 μg/mL，100 μg/mL，200 μg/ mL）及0.2mmol/L 1,1-二苯基-2-苦基苯肼自由基（DPPH·）2 mL，搖勻，室溫避光，靜置30 min，于波長517 nm處測定樣品溶液的吸光度值（Ax）；對照組以無水乙醇代替樣品液；以與樣品液相同濃度的抗壞血酸做為陽性對照。DPPH·自由基清除率（%）=［（A0-Ax）/A0］×100%（式中A0：空白對照組的吸光度值；Ax：樣品溶液的吸光度值）。

1.3.4羥自由基（·OH）清除作用測定采用微改良Smirnof法，分別移取1 mL一定濃度的樣品液（10 μg/mL，20 μg/mL，50 μg/mL，100 μg/mL，200 μg/mL）于10 mL的具塞比色管中，按順序依次加入6 mmol/L FeSO41 mL，6 mmol/L水楊酸1 mL，最后加入6 mmol/LH2O21 mL啟動反應(yīng)，37℃水浴下反應(yīng)1 h。于波長510 nm下測量各管的吸光度值（Ax）。對照組以蒸餾水代替樣品液，測得的吸光度值記為A0。羥基自由基的清除率（%）=［（A0-Ax）/A0］×100%（式中A0：空白對照組的吸光度值；Ax：樣品溶液的吸光度值）。

1.3.5超氧陰離子自由基（·O2-）清除作用測定

采用鄰苯三酚自氧化法，向10 mL具塞比色管中分別加入1 mL一定濃度的樣品液（10 μg/mL，20 μg/mL，50 μg/mL，100 μg/mL，200 μg/mL），之后加入0.05 mol/L pH值8.0的Tris（三羥甲基氨基甲烷）-HCL緩沖液4.0 mL，混勻，置于25℃水浴鍋中預(yù)熱20 min，然后加入2.5 mmol/L鄰苯三酚溶液0.4 mL，混勻后，于25℃水浴鍋中反應(yīng)3 min，最后加入2 mol/L HCL 1.0 mL終止反應(yīng)。于波長325 nm處測定吸光度值?？瞻讓φ战M以蒸餾水代替樣品溶液，其余操作相同。超氧陰離子自由基（·O2-）清除率（%）=［（A0-Ax）/A0］×100%（式中A0：鄰苯三酚的自氧化率；Ax：樣品溶液的自氧化率）。

2　結(jié)果與討論

2.1甜蕎總黃酮含量的測定蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線見圖1，得回歸方程：Y=25.112X-0.0416，R2=0.9986，R=0.9993。根據(jù)前述總黃酮提取方法，準(zhǔn)確移取1 mL待測提取液定容至10 mL，于380 nm處測定其吸光度，A=0.291，根據(jù)回歸方程，計算得X= 0.0132 mg/mL。根據(jù)1.3.2總黃酮計算公式，甜蕎總黃酮含量為4.365 mg/g。

2.2甜蕎總黃酮對DPPH·自由基清除作用

DPPH·是人工合成的以氮為中心的穩(wěn)定自由基，在溶液中呈現(xiàn)深紫色，于517 nm波長處具有強烈的吸收。當(dāng)有自由基清除劑存在時，可與DPPH·的單電子配對而使其被中和，此時溶液變?yōu)闇\黃色或無色，吸光度值變小。利用這一反應(yīng)特性，DPPH·常被用于抗氧化劑的體外抗氧化活性評價。甜蕎總黃酮提取物對DPPH·自由基的清除作用見圖2。

圖1　蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線

圖2　甜蕎總黃酮對DPPH·自由基清除作用

由圖2可知，甜蕎總黃酮提取物具有較強的DPPH·自由基清除能力，在10 μg/mL～200 μg/mL的濃度范圍內(nèi)，隨著黃酮濃度的增加，其對DPPH·自由基的清除能力也逐漸增強，當(dāng)黃酮提取物濃度達到200 μg/mL時，DPPH·清除率可達56.62%。但甜蕎黃酮對DPPH·的清除作用明顯低于等濃度維生素C溶液，其IC50分別為136.539 μg/mL和24.021 μg/mL。

2.3甜蕎總黃酮對羥自由基（·OH）清除作用羥自由基（·OH）屬活性氧的一種，是生物體代謝過程中產(chǎn)生的一種較活潑且危害很強的自由基?？烧T發(fā)組織中的蛋白質(zhì)、氨基酸、核酸、糖類等發(fā)生脂質(zhì)過氧化，其對細(xì)胞內(nèi)DNA的破壞能力最強，可引起DNA氧化損傷和堿基破壞，導(dǎo)致細(xì)胞壞死、老化和突變。本試驗以等濃度維生素C溶液作為陽性對照，根據(jù)Fenton反應(yīng)體系，測定甜蕎總黃酮提取物對羥自由基（·OH）的清除作用。結(jié)果見圖3。

圖3　甜蕎總黃酮對羥自由基的清除作用

由圖3可知，當(dāng)黃酮提取物濃度在10 μg/ mL～50 μg/mL范圍內(nèi)時，隨著濃度的提高，其對羥自由基的清除能力上升較明顯；當(dāng)黃酮提取物濃度在50 μg/mL～200 μg/mL時，其對羥自由基的清除能力雖有提高，但變化不顯著。與等濃度維生素C溶液比較，黃酮提取物的羥自由基清除能力偏低，其IC50為603.583 μg/mL。

2.4甜蕎總黃酮對超氧陰離子自由基（·O2-）清除作用鄰苯三酚于弱堿性條件下可迅速發(fā)生自氧化反應(yīng)，生成超氧陰離子自由基（·O2-）及有色中間體。當(dāng)加入抗氧化劑后，其可將超氧陰離子自由基歧化生成O2和H2O2，進而抑制了鄰苯三酚的自氧化。該過程產(chǎn)生的有色中間體累積濃度與時間可呈線性關(guān)系，于特定波長下測定紫外吸收值，即可得到加入抗氧化劑后的鄰苯三酚自氧化率，繼而求出抗氧化劑對超氧陰離子自由基的清除能力。甜蕎總黃酮提取物對超氧陰離子自由基的清除作用見圖4。

圖4　甜蕎總黃酮對超氧陰離子自由基的清除作用

由圖4可知，甜蕎總黃酮提取物對超氧陰離子自由基表現(xiàn)出較強的清除能力，在10 μg/mL～200 μg/mL的濃度范圍內(nèi)，隨著黃酮濃度的增加，對超氧陰離子自由基的清除能力也顯著增強，其清除作用與濃度呈現(xiàn)一定的相關(guān)關(guān)系。但總黃酮提取物的超氧陰離子自由基清除能力低于等濃度維生素C溶液，其IC50分別為269.622 μg/mL和60.137 μg/mL。

3　結(jié)論

黃酮類化合物是一組以2-苯基色原酮為基本母核的植物多酚類物質(zhì)，屬植物次生代謝產(chǎn)物，多以游離態(tài)或苷的形式廣泛存在于自然界各類植物的葉、莖、花和果實中[6]，目前已知的種類有近萬種。黃酮類化合物因其特殊的結(jié)構(gòu)而具有多種生理功能，包括抗腫瘤、抗心血管疾病、抗菌抗病毒、抗氧化及衰老、免疫調(diào)節(jié)、抗糖尿病、激素樣作用等[7]。

蕎麥中含有較豐富的黃酮類化合物，薛長暉[8]采用液質(zhì)聯(lián)用法從山西產(chǎn)苦蕎粉的提取液中分離了包括萬壽菊素、蘆丁、槲皮素等共5種黃酮類化合物，并分別測定它們的含量，發(fā)現(xiàn)山西產(chǎn)苦蕎中的黃酮種類以蘆丁為主，提取液中的含量高達63.23%；徐寶才[9]等通過反向液相色譜法，在四川產(chǎn)苦蕎中首次檢測出了山奈酚，同時利用液質(zhì)聯(lián)用法檢測了苦蕎總黃酮及蘆丁、山奈酚等6中黃酮醇的含量，發(fā)現(xiàn)四川苦蕎粉的總黃酮含量最高可達4.614%。近年來，國內(nèi)多位學(xué)者利用從蕎麥花、葉、籽粒和種皮中提取的黃酮化合物進行藥理功能測定，發(fā)現(xiàn)蕎麥黃酮對實驗動物具有降血脂、降血糖、抗炎、鎮(zhèn)痛、擴血管和改善心肌缺血等多種藥理活性[10-13]。

甜蕎和苦蕎是蕎麥的主要食用品種，均具有較高的營養(yǎng)價值，但以往對蕎麥的研究多偏重苦蕎，這可能與苦蕎中黃酮等多酚類物質(zhì)含量更高有關(guān)[5]。但苦蕎在我國屬于小宗種植的雜糧作物，種植范圍小、產(chǎn)量低，且苦蕎因口感偏苦，影響了其市場推廣和工業(yè)產(chǎn)品開發(fā)，目前市場上常見的產(chǎn)品類型多為苦蕎茶、苦蕎醋等少數(shù)品種。甜蕎雖然生物有效成分的含量低于苦蕎，但在我國種植面積廣、產(chǎn)量大、資源豐富，且口感更易為消費者接受，因此甜蕎功能食品的開發(fā)更具市場潛力。本試驗以甜蕎為原料，乙醇回流法提取總黃酮化合物，并測定了提取物的體外抗氧化活性。結(jié)果顯示，在測定的濃度范圍內(nèi)，甜蕎黃酮提取物能有效清除DPPH·自由基，且隨著提取物濃度的升高，其自由基清除能力也顯著提高，這可能與黃酮提取物通過直接還原作用將自身攜帶的電子傳遞給DPPH·自由基而生成了DPPH2有關(guān)[14]；黃酮提取物對超氧陰離子自由基也表現(xiàn)出較強的清除能力，其清除作用與濃度呈現(xiàn)一定的相關(guān)關(guān)系，這可能與提取物中的還原性物質(zhì)對鄰苯三酚自氧化過程的抑制有關(guān)；但在本試驗條件下，甜蕎黃酮提取物對羥自由基的清除作用并不顯著，遠(yuǎn)低于等濃度的維生素C溶液，其IC50為603.583 μg/mL，出現(xiàn)此種結(jié)果的原因有待進一步研究。此外，本試驗中使用的甜蕎黃酮提取物為粗品，成分多樣，且含有較多的雜質(zhì)，對試驗結(jié)果有一定的干擾，同時粗品本身也限制了從分子水平上闡述甜蕎黃酮的功能。因此，在初步測定甜蕎總黃酮體外抗氧化活性的基礎(chǔ)上，對提取物的純化和構(gòu)效關(guān)系的研究是今后探討的方向。

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Study on Antioxidant Effect of Total Flavonoid Extracts from Common Buckwheat in vitro

XU Bin，SONG Chun-mei，DU Juan，GE Hong-juan
（Jilin Medical College，Jilin 132013，China）

Abstract：To the explore antioxidant effect of the total flavonoid extracts from common buckwheat in vitro the scavenging ef?fect of total flavonoids of buckwheat on DPPH·free radical was determined by DPPH method，the scavenging effect on hydroxyl free radical（·OH）was determined by the improved Smirnof method，and the scavenging ability on superoxide anion free radical（· O2-)was determined by the adjacent benzene three phenolic autoxidation.The results showed that,in the experimental concentration range，total flavonoid extracts from common buckwheat could evidently eliminate the DPPH·free radical and superoxide anion free radical（·O2-）.With the increased concentration of the extract，the free radical scavenging ability was also significantly improved. It is suggested that the total flavonoid extracts from common buckwheat has the antioxidative activity in vitro.

Key words：common buckwheat；total flavonoid；antioxidant activity

通訊作者：宋春梅，E-mail：1209816131@qq.com

作者簡介：徐斌（1972-），男，副教授，碩士，研究方向為抗氧化及保健食品研究開發(fā)，E-mail：xb-jl@163.com

基金項目：吉林省科技廳項目“人體血漿黃酮含量與高脂血癥關(guān)系及黃酮類化合物營養(yǎng)干預(yù)的實驗研究”（201105089）

收稿日期：2015-03-23

中圖分類號：R 285

文獻標(biāo)志碼：A

文章編號：0529- 6005（2015）10- 0053- 04