郭曉秋，曲哲會(huì)，劉　濤（信陽(yáng)農(nóng)林學(xué)院動(dòng)物科學(xué)系，河南信陽(yáng)464000）

豬偽狂犬病病毒和豬圓環(huán)病毒2型多重PCR檢測(cè)方法的建立與初步應(yīng)用

郭曉秋，曲哲會(huì)，劉濤
（信陽(yáng)農(nóng)林學(xué)院動(dòng)物科學(xué)系，河南信陽(yáng)464000）

摘要：為了建立可同時(shí)檢測(cè)豬偽狂犬病病毒（PRV）和豬圓環(huán)病毒2型（PCV-2）的多重PCR檢測(cè)方法，本研究根據(jù)GenBank中登錄的PRV gE基因和PCV-2 ORF2基因的核苷酸序列，分別設(shè)計(jì)了2對(duì)特異性引物PRV-S/PRV-A和PCV-2-S/PCV-2-A，產(chǎn)物分別為270 bp和189 bp。檢測(cè)結(jié)果顯示，該方法具有較高特異性，檢測(cè)PRV和PCV-2的DNA最低量均為1×10-4μg/μL。對(duì)136份臨床上疑似為PRV和PCV-2感染病料樣品進(jìn)行檢測(cè)的結(jié)果表明，本研究建立的多重PCR檢測(cè)方法可用于臨床上PRV和PCV-2引起的單純或混合感染的傳染病病原學(xué)診斷。

關(guān)鍵詞：豬偽狂犬病病毒；豬圓環(huán)病毒2型；多重PCR

豬偽狂犬?。≒R）是由豬偽狂犬病病毒（Pseu?dorabies virus，PRV）引起的一種急性傳染病，臨床上以妊娠期母豬感染后引起流產(chǎn)、死胎及木乃伊胎，仔豬感染后出現(xiàn)神經(jīng)癥狀為主要特征，且病死率可達(dá)100%。豬圓環(huán)病毒病（Porcine circovirus diseases，PCVD）是指由圓環(huán)病毒2型（PCV-2）為主要病原、單純或繼發(fā)（或混合）感染其他致病微生物而引起的一系列綜合征的總稱。PCV-2是引起仔豬斷奶后多系統(tǒng)衰竭綜合征（PMWS）和母豬繁殖障礙、斷奶和育肥豬的呼吸道疾病，豬皮炎和腎病綜合征（PDNS）以及豬的先天性震顫的主要病原。近年來(lái)，PR和PCVD已經(jīng)成為威脅我國(guó)養(yǎng)豬業(yè)最主要的傳染病之一，不僅導(dǎo)致飼料轉(zhuǎn)化率降低，生長(zhǎng)緩慢，而且由PR和PCV-2引起的混合感染或繼發(fā)感染其他豬病的暴發(fā)與流行，造成治療費(fèi)用增加，嚴(yán)重者可引起大批豬只死亡，給養(yǎng)豬業(yè)帶來(lái)了空前巨大的經(jīng)濟(jì)損失，嚴(yán)重制約了養(yǎng)豬業(yè)的持續(xù)健康發(fā)展。

由于常規(guī)的病原學(xué)和血清學(xué)診斷方法存在操作繁雜，耗時(shí)長(zhǎng)，靈敏度低等不足，難以用于混合感染時(shí)兩種疾病的早期快速診斷。而多重PCR技術(shù)可對(duì)多個(gè)目的基因同時(shí)進(jìn)行擴(kuò)增的診斷方法，具有快速、敏感、高效、易于操作等優(yōu)點(diǎn)，已廣泛用于多種疫病的實(shí)驗(yàn)室診斷中。基于以上原因，本研究依據(jù)PRV和PCV-2保守基因序列，設(shè)計(jì)并合成了2對(duì)特異性引物，建立了可以同時(shí)檢測(cè)PRV和PCV-2的多重PCR檢測(cè)方法，通過(guò)初步臨床應(yīng)用，可完全滿足臨床上由PRV和PCV-2引起的單純或混合感染的準(zhǔn)確診斷。

1　材料與方法

1.1病毒株與病料豬偽狂犬病病毒（PRV）、豬圓環(huán)病毒2型（PCV-2）、豬圓環(huán)病毒1型（PCV-1）、豬瘟病毒（CSFV）、豬細(xì)小病毒（PPV）和豬繁殖與呼吸綜合征病毒（PRRSV）均為北京世紀(jì)元亨動(dòng)物防疫技術(shù)有限公司的PCR檢測(cè)試劑盒陽(yáng)性對(duì)照。136份疑似為PRV和PCV-2感染的病料（包括有血清、淋巴結(jié)、肺臟、脾臟和腦組織）為2012-2013年期間信陽(yáng)農(nóng)林學(xué)院動(dòng)物疫病檢測(cè)實(shí)驗(yàn)室收集保存。

1.2主要試劑細(xì)胞/組織基因DNA提取試劑盒（離心柱型）和Gen Clean瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒（離心柱型），購(gòu)自上海捷瑞生物工程有限公司；2×Power Taq PCR MasterMix和DNA Marker DL-2 000，購(gòu)自百泰克生物技術(shù)（北京）有限公司；瓊脂糖為BBI公司生產(chǎn)；其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.3引物設(shè)計(jì)利用DNAMAN軟件分別對(duì)GenBank 中12株P(guān)RV和12株P(guān)CV-2基因序列進(jìn)行同源性比較，分別選擇PRV gE基因和PCV-2的ORF2基因保守區(qū)域，利用生物軟件Primer 5.0設(shè)計(jì)2對(duì)引物，具體序列如下，PRS：5′-ATGGGCATCGGCGACTACCT-3′；PRV-A：5′-GCGAGAAGAGCTGGGAGTGGA-3′；PCV-2-S：5′-GTTATGGTATGGCGGGAGG-3′；PCV-2-A：5′-CCGCTGTGCCCTTTGA-3′，預(yù)計(jì)PRV擴(kuò)增片段為270 bp，PCV-2擴(kuò)增片段為189 bp。引物由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。

表1　PCR檢測(cè)引物序列

1.4病料樣品的處理及基因組DNA的提取選擇發(fā)病動(dòng)物血清、肺臟、脾臟、淋巴結(jié)和流產(chǎn)胎兒為檢測(cè)樣品，具體處理方法參照文獻(xiàn)[1]。參照組織/細(xì)胞基因組DNA提取試劑盒（離心柱型）使用說(shuō)明書提取病料中的基因組DNA。

1.5單項(xiàng)PCR反應(yīng)PCR反應(yīng)體系（25 μL）：PCR反應(yīng)液12.5 μL、DNA模板3 μL、PRV-S（10 μmol/L）/PRV-A（10 μmol/L）（或PCV-2-S/PCV-2-A）各0.75 μL、加無(wú)菌去離子水至25 μL。PCR反應(yīng)程序：95℃5 min，95℃30 s、55℃30 s、72℃ 30 s、共35個(gè)循環(huán)，72℃7 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳后，紫外燈下觀察結(jié)果。

1.6PRV和PCV-2的多重PCR檢測(cè)按照單項(xiàng)PCR反應(yīng)體系，其中引物PRV-S、PRV-A（10 μmol/L）、PCV-2-S（10 μmol/L）、PCV-2-A（10 μmol/L）各0.75 μL。反應(yīng)條件同單項(xiàng)PCR反應(yīng)。分別對(duì)PRV陽(yáng)性對(duì)照、PCV-2陽(yáng)性對(duì)照以及PRV和PCV-2混合物進(jìn)行檢測(cè)。

1.7特異性試驗(yàn)利用該多重PCR檢測(cè)方法同時(shí)對(duì)CSFV、PRRSV、PCV-1和PPV進(jìn)行檢測(cè)，以PRV和PCV-2混合物作為陽(yáng)性對(duì)照，以確定該方法的特異性。

1.8敏感性試驗(yàn)利用微量分光光度計(jì)分別對(duì)提取的PRV和PCV-2陽(yáng)性對(duì)照DNA進(jìn)行含量測(cè)定，然后稀釋、混合成濃度均為1 μg/μL，按照10倍進(jìn)行倍比稀釋，利用該多重PCR檢測(cè)方法對(duì)DNA含量依次為1 μg/μL～1×10-6μg/μL進(jìn)行檢測(cè)，以確定該方法的敏感性。

1.9初步臨床應(yīng)用按照步驟1.4將2012-2013年收集的136份疑似PRV或PCV-2感染病料進(jìn)行處理，按照該多重PCR檢測(cè)方法進(jìn)行檢測(cè)，同時(shí)以PRV和PCV-2的單項(xiàng)PCR檢測(cè)方法和商品試劑盒進(jìn)行檢測(cè)，將檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行比較、分析，以確定該方法的臨床應(yīng)用效果。

2　結(jié)果

圖1　單項(xiàng)PCR分別檢測(cè)PRV和PCV- 2結(jié)果

2.1單項(xiàng)PCR檢測(cè)PRV和PCV-2結(jié)果如圖1所示，以提取PRV陽(yáng)性對(duì)照的DNA為模板，以引物PRV-S/PRV-A為檢測(cè)引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，結(jié)果顯示，擴(kuò)增出特異的270 bp的條帶，經(jīng)過(guò)序列測(cè)定，與AP207700、AY170318和AY249861的同源性分別為98.15%、99.22%和98.81%。以提取PCV-2陽(yáng)性對(duì)照的DNA為模板，以引物PCV-S/PCV-A為檢測(cè)引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，結(jié)果顯示，擴(kuò)增出特異的189 bp的條帶，經(jīng)過(guò)序列測(cè)定，與AF027217、AY641542和GU124593同源性分別為97.77%、98.24%和97.93%。

2.2多重PCR檢測(cè)PRV和PCV-2結(jié)果如圖2所示，以提取的PRV和PCV-2混合物DNA為模板，以及分別提取PRV和PCV-2的DNA為模板，利用引物PRV-S/PRV-A和PCV-2-S/PCV-2-A混合物進(jìn)行多重PCR檢測(cè)，分別出現(xiàn)了與預(yù)計(jì)相符（270 bp和189 bp）的特異片段，2種病毒混合物檢測(cè)后，同時(shí)出現(xiàn)了大小差異明顯的270 bp和189 bp片段。

圖2　多重PCR檢測(cè)PRV、PCV- 2及混合物結(jié)果

2.3特異性試驗(yàn)結(jié)果結(jié)果如圖3所示，PRV和PCV-2的DNA混合物，經(jīng)多重PCR檢測(cè)，出現(xiàn)了270 bp和189 bp特異2條目的片段，而CSFV和PRRSV的RNA反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物、PPV和PCV-1的DNA為模板，多重PCR檢測(cè)結(jié)果均為陰性。說(shuō)明PRV和PCV-2的多重PCR檢測(cè)方法具有良好的特異性。

2.4敏感性試驗(yàn)結(jié)果利用微量分光光度計(jì)，將分別提取的PRV和PCV-2的DNA進(jìn)行含量測(cè)定，然后稀釋、混合成總濃度均為1 μg/μL，并進(jìn)行10倍稀釋，依次為1×10-1μg/μL、1×10-2μg/μL、1×10-3μg/μL、1× 10-4μg/μL、1×10-5μg/μL，分別進(jìn)行多重PCR檢測(cè)。結(jié)果如圖4所示，PRV和PCV-2的DNA最小檢測(cè)量均為1×10-4μg/μL。

圖3　多重PCR檢測(cè)方法的特異性試驗(yàn)結(jié)果

圖4　多重PCR檢測(cè)方法的敏感性試驗(yàn)結(jié)果

表2　136份臨床病料多重PCR、單項(xiàng)PCR及商品試劑盒檢測(cè)結(jié)果的比較

2.5多重PCR檢測(cè)方法對(duì)臨床病料檢測(cè)結(jié)果分別利用多重PCR檢測(cè)方法，PRV和PCV-2的單項(xiàng)PCR檢測(cè)方法以及PRV和PCV-2商品試劑盒對(duì)136份臨床疑似PRV和PCV-2單純或混合感染的病料進(jìn)行檢測(cè)，具體結(jié)果見(jiàn)表2，PRV和PCV-2多重PCR檢測(cè)結(jié)果與單項(xiàng)結(jié)果符合率為100%，PRV和PCV-2多重PCR檢測(cè)結(jié)果與PRV和PCV-2商品試劑盒檢測(cè)結(jié)果比較來(lái)看，PCV-2單純感染檢測(cè)結(jié)果符合率為100%，PRV單純感染檢測(cè)結(jié)果符合率為95.92%，PRV和PCV-2混合感染檢測(cè)結(jié)果符合率為96.00%。說(shuō)明本研究建立的PRV和PCV-2多重PCR檢測(cè)結(jié)果完全可以滿足臨床診斷的要求。

3　討論

隨著分子生物學(xué)的不斷發(fā)展，PCR檢測(cè)方法以其靈敏性高、特異性強(qiáng)、操作時(shí)間短等特點(diǎn)，已經(jīng)廣泛應(yīng)用于動(dòng)物傳染病病原體檢測(cè)方面[2-4]。但由于臨床經(jīng)常出現(xiàn)多病原的混合感染的病例，因此研究快速而靈敏地鑒別診斷多種病原體的診斷方法尤為重要。多重PCR技術(shù)可對(duì)在同一體系中的多個(gè)目的基因進(jìn)行擴(kuò)增的，不僅具有單項(xiàng)PCR方法的快速、敏感、高效、易于操作等優(yōu)點(diǎn)，而且對(duì)臨床混合感染的鑒別診斷尤為有效，并且與單項(xiàng)PCR相比，大大節(jié)省診斷試劑費(fèi)用和操作時(shí)間[5]。本研究建立的PRV和PCV-2的多重PCR檢測(cè)方法，通過(guò)特異性、敏感性和初步臨床應(yīng)用來(lái)看，可以特異、準(zhǔn)確地檢測(cè)PRV和PCV-2的DNA，PCR產(chǎn)物分別為270 bp和189 bp，通過(guò)與Marker DL-2 000比較，可明顯分別位于250 bp的上下，最低可以檢測(cè)到DNA量均為1× 10-4μg/μL，通過(guò)對(duì)臨床采集136份病料檢測(cè)，PRV 和PCV-2多重PCR檢測(cè)結(jié)果與單項(xiàng)結(jié)果及PRV和PCV-2商品試劑盒檢測(cè)結(jié)果比較來(lái)看，該方法完全可以滿足臨床病原體診斷的要求。

PCR檢測(cè)方法的準(zhǔn)確性與目的基因的選擇及引物設(shè)計(jì)有很大關(guān)系，本研究選擇了PRV的gE基因和PCV-2的ORF2基因作為參考基因。雖然目前已有PRV的PCR檢測(cè)方法的建立，但引物設(shè)計(jì)大多選擇gB基因、gD基因和TK基因等保守部分[5-7]，無(wú)法避免疫苗毒的干擾造成結(jié)果假陽(yáng)性問(wèn)題。本研究選擇gE基因是PRV的主要毒力因子，作用在于能降低PRV對(duì)豬神經(jīng)系統(tǒng)的侵襲能力，而且是PRV復(fù)制所必需的，而且目前國(guó)內(nèi)使用的PRV弱毒疫苗至少為gE基因缺失苗，所以利用gE基因序列作為參考基因，選擇保守區(qū)域設(shè)計(jì)合成的引物，建立的PCR檢測(cè)方法完全解決了疫苗毒對(duì)檢測(cè)結(jié)果的干擾問(wèn)題。PCV有PCV-1和PCV-2 2個(gè)血清型。PCV-1在豬體內(nèi)普遍存在，無(wú)致病性，PCV-2具有致病性，是引起PMWS、PDNS以及豬的先天性震顫等混合感染的主要病原。PCV-1和PCV-2的基因同源性較高，如果引物設(shè)計(jì)不當(dāng)，容易造成誤檢，所以本研究比較GenBank中多個(gè)PCV-1和PCV-2的基因序列同源性，設(shè)計(jì)了特異檢測(cè)引物PCV-2-S/PCV-2-A，經(jīng)特異性試驗(yàn)表明，可以鑒別PCV-1和PCV-2。

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Thedevelopment and preliminary application of multiplex PCR for detection of PRV and PCV- 2

GUO Xiao-qiu，QU Zhe-hui，LIU Tao
（Department of Animal Science，Xingyang College of Agriculture and Forestry，Xinyang 464000，China）

Abstract：To establish the assay for detections of pseudorabies virus（PRV）and Porcine circovirus type 2（PCV-2），a multi?plex RT-PCR was developed with two pair specific primers of PRV-S/PRV-A and PCV-2-S/PCV-2-A designed for detecting PRV and PCV-2 based on the gE gene and ORF2 gene sequences in GenBank respectively.The results showed that the assay was able to detect PRV and PCV-2 simultaneously by amplifying DNA fragments of 270 bp and 189 bp，respectively.The sensitivity of the assay was 1×10-4μg/μL of DNA. Our result of the 136 tested clinical sample suggest that the Multiplex PCR detection meth?ods can be used to detect the PRV and PCV-2.

Key words：Pseudorabies Virus；Porcine circovirus type 2；Multiplex PCR Corresponding author：LIU Tao

通訊作者：劉濤，E-mail：decai178@163.com

作者簡(jiǎn)介：郭曉秋（1979-），女，講師，碩士，主要從事動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)與飼料的教學(xué)與科研工作，E-mail:guoxiaoqiu_1979@163.com

基金項(xiàng)目：信陽(yáng)市科技攻關(guān)項(xiàng)目（20130017）

收稿日期：2014-03-30

中圖分類號(hào)：S852.4

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號(hào)：0529- 6005（2015）10- 0034- 04