王玉東，王永玲，王君瑋，王曉燕，高艷艷，王樹雙，譚金山，牛鐘相（.中國動(dòng)物衛(wèi)生與流行病學(xué)中心，山東青島660；.中國農(nóng)業(yè)大學(xué)國際合作與交流處，北京海淀0008；.青島大學(xué)醫(yī)學(xué)院，山東青島660；.山東農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，山東泰安708）

山東分離株雞腺胃型傳染性支氣管炎的病理組織學(xué)和電鏡觀察

王玉東1，王永玲1，王君瑋1，王曉燕2，高艷艷1，王樹雙1，譚金山3，牛鐘相4
（1.中國動(dòng)物衛(wèi)生與流行病學(xué)中心，山東青島266032；2.中國農(nóng)業(yè)大學(xué)國際合作與交流處，北京海淀100083；3.青島大學(xué)醫(yī)學(xué)院，山東青島266021；4.山東農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，山東泰安271018）

摘要：為探討雞腺胃型傳染性支氣管炎病毒（腺胃型IBV）引起雞的病理組織變化和病毒超微結(jié)構(gòu)特征，采用常規(guī)臨床剖檢、病理組織學(xué)顯微觀察技術(shù)及電子顯微鏡觀察技術(shù)，對(duì)山東省3株病毒分離株（QX、DY、FC）引起的病理組織學(xué)變化和病毒的超微結(jié)構(gòu)進(jìn)行觀察。結(jié)果表明，分離毒株可引起明顯的腺胃組織炎癥，主要表現(xiàn)腺胃黏膜內(nèi)炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，腺胃腺體上皮細(xì)胞增生，腺腔中有黏液、有多量壞死、脫落、崩解的腺細(xì)胞，以及單核細(xì)胞浸潤(rùn)，上皮細(xì)胞有多量空泡化等特點(diǎn)。在病理組織中觀察到了大小為80～120 nm的病毒顆粒；通過雞胚分離的病毒大小為80～150 nm，該病毒略呈球形或梨形，有囊膜，囊膜表面覆有長(zhǎng)12～25 nm的呈典型冠狀的突起（團(tuán)集的病毒則較少有冠狀突起），為冠狀病毒。該結(jié)果為進(jìn)一步研究和有效防治腺胃型傳染性支氣管炎提供了科學(xué)參考。

關(guān)鍵詞：雞；傳染性支氣管炎；腺胃型；病毒；病理組織；電鏡觀察

Corresponding author：NIU Zhong-xiang

近年來，以雞腺胃腫大、黏膜增厚、潰瘍出血、有膿性分泌物、死亡率較高為特征的腺胃型傳染性支氣管炎的發(fā)生呈上升趨勢(shì)，對(duì)養(yǎng)雞業(yè)造成了嚴(yán)重威脅。由Y.M.Saif主編的《禽病學(xué)》引用了王玉東關(guān)于雞腺胃型傳染性支氣管炎（QX IBV）分離株的報(bào)道[1]。2001年潘杰彥等[2]報(bào)道中國青島腺胃型傳支病毒株（SD/97/02株原稱QX IBV株）的S1基因全序列及推導(dǎo)出的氨基酸序列被病毒基因庫（Gen?Bank）所收錄，收錄號(hào)為AF193423。隨后QX樣IBV在歐洲、亞洲和非洲等地多有發(fā)生，在許多研究中均參照QX IBV基因型。王玉東等[3]通過對(duì)山東分離株S基因的克隆和序列分析，表明腺胃型IBV山東分離株QX株和DY株是不同于呼吸型和腎型IBV的嗜腺胃型的IBV變異株，腺胃型QX株和DY株的相似性為95.8%。王玉東等[4-6]認(rèn)為，本病病原是一種冠狀病毒屬的嗜腺胃型的傳染性支氣管炎病毒變異株。王玉東等[7]進(jìn)行的國內(nèi)有關(guān)分離毒株（QX、BJ、DY）進(jìn)行未免疫同源動(dòng)物回歸試驗(yàn)取得了成功。王玉東等[8]用腺胃型傳染性支氣管炎病毒山東分離毒株對(duì)SPF雞致病性試驗(yàn)取得了成功。本研究對(duì)山東典型分離株的病理組織學(xué)變化和病毒超微結(jié)構(gòu)進(jìn)行了電鏡觀察，取得了滿意的結(jié)果，為進(jìn)一步研究和防治雞腺胃型傳染性支氣管炎提供了科學(xué)依據(jù)。

1　材料與方法

1.1病雞或病死雞25～80日齡病雞和病死雞，取自山東省青島市、東營(yíng)市和肥城市等地發(fā)病的養(yǎng)雞場(chǎng)。

1.2病毒分離株山東省腺胃型IBV典型分離株青島株（QX IBV）[6]、東營(yíng)株（DY IBV）、肥城株（FC IBV），均由中國動(dòng)物衛(wèi)生與流行病學(xué)中心分離、鑒定和保存。

1.3儀器組織切片機(jī)，購自德國萊卡公司；LKB-V型超薄組織切片機(jī)，購自瑞典BROMMA公司；光學(xué)顯微鏡，購自日本OLYMPUS公司；JEOL-100cxⅡ型透射電鏡，購自日本電子株式會(huì)社（JE?OL公司）；電子顯微鏡，購自日本HITACHI公司。

1.4病理組織學(xué)標(biāo)本制備取臨床自然發(fā)病雞或回歸試驗(yàn)病死雞中表現(xiàn)明顯腫脹的腺胃、腎臟及其他相關(guān)病料，切成豆粒狀大小用2.5%戊二醛保存。觀察時(shí)用10%中性福爾馬林固定，用組織切片機(jī)常規(guī)石蠟切片，蘇木素－伊紅（H.E.）染色，光鏡觀察。

1.5病毒分離和電鏡觀察取發(fā)病雞腺胃，研磨器研碎，制成10%生理鹽水組織懸液，上清經(jīng)無菌處理后，接種10日齡SPF雞胚尿囊腔，0.2 μL/枚，置37℃繼續(xù)孵育，接種后24 h照蛋，死胚棄掉；孵育至5～6 d，收獲雞胚尿囊液。然后盲傳4～5代，致嚴(yán)重的雞胚侏儒化時(shí)取山東分離株QX株、DY株和FC株病毒尿囊液，不離心，用2%磷鎢酸負(fù)性染色5～10 min后，進(jìn)行電子顯微鏡觀察。

對(duì)分離的尿囊液病毒在4℃下，15 000 r/min分別離心20 min，取上清，36 000 r/min離心3 h，取沉淀，用少量PBS溶解稀釋，用2%磷鎢酸負(fù)性染色5～10 min，進(jìn)行電子顯微鏡觀察。參照王碧林的方法進(jìn)行離心[9]。

1.6腺胃組織中病毒觀察剖殺病雞，取腺胃組織，切成1 mm3大小，2.5%戊二醛固定2 h，用0.1 mol/L pH值為7.4的磷酸鹽緩沖液（PBS）洗滌，用1%鋨酸后固定2 h，酒精逐級(jí)脫水，無水丙酮替換，Epon812包埋樹脂聚合、包埋，LKB-V型超薄切片機(jī)切片，撈取呈金－銀色切片，醋酸鈾－檸檬酸鉛雙重染色，用JEOL-100cxⅡ型透射電鏡觀察并照相。參照吳延功等[10]進(jìn)行超薄切片制作和觀察。

2　結(jié)果

2.1病理剖檢將收集的25～80日齡發(fā)病雞和病死雞剖檢，均發(fā)現(xiàn)雞體極度消瘦，腺胃腫大如球狀（見中插彩版圖1）。腺胃壁增厚明顯，其黏膜有出血和潰瘍，乳頭平整融合，輪廓不清，可擠出膿性分泌物。有的腺胃腫脹、出血，乳頭消失凹陷，形成出血潰瘍?cè)睢＜∥附琴|(zhì)膜個(gè)別有潰瘍，胰腺腫大有出血點(diǎn)，盲腸扁桃體腫大出血。十二指腸黏膜有出血，空腸和直腸及泄殖腔黏膜有不同程度的出血。腔上囊正?；蚵杂心[大。有的雞腎臟腫大，腎臟和輸尿管積有白色尿酸鹽。

2.2病理組織學(xué)將病變腺胃用常規(guī)石蠟切片、蘇木素－伊紅（H.E.）染色、鏡檢發(fā)現(xiàn)，腺胃乳頭出口部有多量黏液并混有多量細(xì)胞。腺胃黏膜內(nèi)炎性細(xì)胞浸潤(rùn)伴潰瘍形成，間質(zhì)血管擴(kuò)張、充血、水腫（見中插彩版圖2）；腺胃腺體上皮細(xì)胞增生，腺腔中有黏液、有多量壞死、脫落、崩解的腺細(xì)胞，以及單核細(xì)胞浸潤(rùn)，上皮細(xì)胞有多量空泡化。管腔中也有脫落的上皮細(xì)胞，腺體下平滑肌層被水腫液分隔，固有層水腫，毛細(xì)血管充血。腺胃腺體內(nèi)有多量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，增生細(xì)胞有淋巴細(xì)胞、白細(xì)胞和漿細(xì)胞等（見中插彩版圖3）；腺胃腫大、炎癥表現(xiàn)嚴(yán)重的病例，病變可以深入到平滑肌層，導(dǎo)致肌肉實(shí)質(zhì)變性或蠟樣壞死。病雞腎臟組織變化主要為腎小球和小管輕度腫脹，間質(zhì)出血（見中插彩版圖4）。

2.3分離病毒電鏡觀察不同分離株病毒經(jīng)電鏡觀察發(fā)現(xiàn)，均有囊膜、多形態(tài)、略呈球形或梨形、直徑為80～150 nm之間，囊膜表面覆有長(zhǎng)12～25nm的冠狀突起。在連續(xù)凍融后，往往看不到明顯的突起，但病毒內(nèi)結(jié)構(gòu)相同。超速離心處理后，有時(shí)觀察到大量病毒團(tuán)集，團(tuán)集病毒其冠狀結(jié)構(gòu)不明顯。山東分離株QX、DY、FC株分離病毒的尿囊液中均未發(fā)現(xiàn)其他病毒，均為單一的冠狀病毒，見圖5～6。

圖5　QX株病毒的電鏡照片，直徑約為120～150 nm（×120 K）

圖6　QX株團(tuán)集病毒電鏡照片，直徑為100～150 nm（×80 K）

2.4腺胃組織病毒電鏡觀察對(duì)QX株腺胃組織進(jìn)行電鏡觀察，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在腺胃組織中有大量直徑為80～120 nm的病毒顆粒存在，見箭頭所指，見圖7。

圖7　QX株球形病毒顆粒，直徑為80～120 nm（×40 K）

3　討論

3.1病毒嗜性山東分離的3株腺胃型IBV毒株具有明顯的嗜呼吸系統(tǒng)、嗜腺胃及腸道等消化系統(tǒng)的特征?；疾‰u主要表現(xiàn)呼吸道癥狀，消瘦，發(fā)育不良，死亡率高。剖檢以腺胃腫大如球狀，腺胃黏膜有出血和潰瘍，腺胃乳頭平整融合，輪廓不清，可擠出膿性分泌物，肌胃角質(zhì)膜個(gè)別有潰瘍、出血、腸道出血等主要特征。

3.2病理組織學(xué)變化主要表現(xiàn)腺胃的炎性變化。腺胃黏膜內(nèi)炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，間質(zhì)血管擴(kuò)張、充血、水腫，腺胃腺體上皮細(xì)胞增生，腺腔中有黏液，有多量壞死、脫落、崩解的腺細(xì)胞，以及單核細(xì)胞浸潤(rùn)，上皮細(xì)胞有多量空泡化等特點(diǎn)。

3.3分離病毒的特征山東分離毒株（QX、DY、FC株）3株病毒液中的分離病毒都呈球形、梨形或多形性，病毒離子大小多在100～120 nm之間,最大為150 nm，最小為80 nm。病毒表面的纖突一般為15～20 nm，當(dāng)超速離心后，觀察到大量的病毒團(tuán)集（如QX株和DY株），團(tuán)集病毒一般看不到表面纖突結(jié)構(gòu)。

本研究從山東分離的3株腺胃型IBV病毒分離物中均未發(fā)現(xiàn)新城疫病毒（100～500 nm，突起長(zhǎng)約8 nm）、網(wǎng)狀內(nèi)皮組織增殖病病毒（100nm,突起長(zhǎng)約6 nm）、呼腸孤病毒（75 nm）、細(xì)小病毒（20～22 nm）等其他病毒存在。據(jù)吳延功研究報(bào)道[10]，對(duì)病毒分離物進(jìn)行電鏡觀察，從青島分離的SDQD97株病毒和另1株病毒皆為冠狀病毒。

王玉東等[8]在進(jìn)行山東分離株病毒未免疫雞致病試驗(yàn)時(shí)，進(jìn)行了外源病毒抗體和白血病抗原的檢測(cè)，均未檢測(cè)到新城疫病毒、馬立克病毒、網(wǎng)狀內(nèi)皮組織增殖病病毒、呼腸孤病毒、傳染性囊病病毒、傳染性貧血病毒等其他外源病毒的抗體，也未檢測(cè)到白血病病毒抗原。

3.4腺胃組織中的病毒特征從QX株病毒感染的腺胃組織中觀察到大小約80～120 nm、呈球形病毒顆粒，經(jīng)鑒定為傳染性支氣管炎病毒（IBV）。未發(fā)現(xiàn)網(wǎng)狀內(nèi)皮組織增殖病病毒（REV）和新城疫病毒（NDV）等其他病毒。經(jīng)對(duì)QX株腺胃組織進(jìn)行電鏡觀察，未發(fā)現(xiàn)吳延功等[10]提及的新城疫病毒、網(wǎng)狀內(nèi)皮組織增殖病病毒及另一種大小為60～80 nm的病毒（分布于細(xì)胞間隙中）。也未發(fā)現(xiàn)呼腸孤病毒，與沈美艷[11]的研究不同。

3.53株山東分離株病毒皆為腺胃型IBV，10多年來，使用腺胃型傳染性支管炎QX株病毒生產(chǎn)的油乳劑滅活疫苗已經(jīng)被廣泛使用。疫苗免疫保護(hù)率在95%以上，疫苗安全性為100%[5，12]。本研究通過對(duì)山東分離株（QX、DY、FC）病毒引起雞的臨床癥狀、病理變化、病毒組織學(xué)特征、分離病毒電鏡觀察，病理組織中病毒的電鏡觀察等研究，表明引起腺胃腫大、黏膜潰瘍出血為特征腺胃型的病原為冠狀病毒屬的傳染性支氣管炎變異株。

腺胃型IBV是不同于呼吸型、腎型、生殖型傳染性支氣管炎病毒（IBV）的變異株，但與腎型IBV毒株有高度的同源性[3，5-6]。國際上當(dāng)前普遍認(rèn)為QX樣IBV為一種腎型傳支株，2008年意大利Ca?logero Terregino等[13]報(bào)道，意大利分離株IBV-QX株對(duì)SPF雞和商品肉雞的致病性及基于IB Ma5和4/91變異株疫苗免疫誘導(dǎo)保護(hù)反應(yīng)的評(píng)價(jià)論文中提到，在蛋雞和肉雞場(chǎng)在1日齡和14日齡時(shí)免疫M(jìn)a5和4/91變異株疫苗，對(duì)降低發(fā)生QX IBV感染時(shí)的經(jīng)濟(jì)損失具有幫助作用。

2004年1月荷蘭Geerligs H J等[14]分離到1株IBV變異株,通過基因庫搜索，該病毒株與中國青島分離株QX IBV毒株具有98.1%的S基因相似度，并將其命名為IB-QX病毒。

3.6腺胃型IBV研究動(dòng)態(tài)近年來該病呈世界性流行，其研究也有較大的發(fā)展。2005年Beato M S等[15]報(bào)道了IBV-QX株在意大利傳播流行的證據(jù)。2011年泰國Tawatchai Pohuang等[16]分離的IBV病毒進(jìn)行S1基因的序列分析，引用了QX IBV的報(bào)道；2012年瑞典Abro S H等[17]報(bào)道，IBV-QX病毒血清型按全長(zhǎng)基因序列分型，除了中國QX血清型外，現(xiàn)分離到許多歐洲QX血清型，包括比利時(shí)、丹麥、法國、德國、匈牙利、意大利、荷蘭、波蘭、俄羅斯、斯羅文尼亞、西班牙、瑞典和英國等都有相關(guān)報(bào)道，其分離毒株的基因序列都與QX IBV接近。2012年伊拉克Amin O G M等[18]報(bào)道了QX樣IBV毒株在中東的傳播，并對(duì)許多國家的病毒分離株進(jìn)行了基因進(jìn)化分析。2012年張小榮等[19]分離的兩株河北分離IBV株屬于QX IBV基因型。2014年德國Mork A K等[20]報(bào)道了冠狀病毒IBV-QX株和B1648病毒纖突蛋白特性的比較。近來來，QX樣IBV感染病例呈現(xiàn)世界范圍蔓延的趨勢(shì)。

建議繼續(xù)開展本病的病原學(xué)研究，確定該病病原，建立防制機(jī)制，完善我國禽病學(xué)IBV相關(guān)內(nèi)容，與國際禽病學(xué)接軌。

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Histopathology and Electron Microscopy Observation of Shandong Isolates of Glandular Stomach Type Avian Infectious Bronchitis Virus

WANG Yu-dong1，WANG Yong-ling1，WANG Jun-wei1，WANG Xiao-yan2，GAO Yan-yan1，WANG Shu-shuang1，TAN Jin-shan3，NIU Zhong-xiang4
（1.China Animal Health and Epidemiology Center，Qingdao 266032，China；2.Office of International Relations，China Agricultural University，Beijing 100083，China；3.College of Medicine，Qingdao University，Qingdao 266021，China；4.College of Animal Science and Technology，Shandong Agricultural University，Tai’an 271018，China）

Abstract：In order to investigate histo-pathological changes of chickens induced by glandular stomach（GS）type avian infec?tious bronchitis virus and the ultra-structure of the virus，clinical dissection，histo-pathology and electron microscopic examination were conducted over the 3 Shandong isolates（QX，DY and FC）of stomach type avian infectious bronchitis virus and the ultrastructure of the virus . The results showed that the isolates induced significant glandular stomach tissue inflammation manifested mainly in inflammatory cell infiltration in proventriculus mucosa，glandular epithelial hyperplasia，mucus and abundant necrotic，exfoliated and disintegrated glandular cells in gland lumen，monocyte infiltration and abundant vacuolation in epithelial cells.Viral particles with 80～120 nm were observed in the pathological tissues .Virus isolated via chicken embryo was too 80～150 nm in size with spherical or pear-shaped form.The virus was enveloped with 12～25 typical coronoid projections（the clustered virus has few coronoid projections），thus named as coronavirus.The study provided scientific reference for further studies and effective pre?vention and control of glandular stomach type avian infectious bronchitis.

Key words：Chicken；Avian infectious bronchitis；Glandular stomach type；Virus；Histopathology；Electron Microsco?py Observation

通訊作者：牛鐘相，E-mail：zxniu@sdau.edu.cn

作者簡(jiǎn)介：王玉東（1964-），男，副研究員，本科，主要從事動(dòng)物疫病防制、生物制品研究及動(dòng)物產(chǎn)品安全檢測(cè)評(píng)估工作，E-mail：andy56789@139.com

收稿日期：2014-11-21

中圖分類號(hào)：S852.65+9.6

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號(hào)：0529- 6005（2015）10- 0024- 04