于　靜，薛　佳，胡艷欣，汪　明（中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，北京海淀100193）

急性熱應(yīng)激對(duì)小鼠肺組織中熱應(yīng)激蛋白和細(xì)胞因子基因表達(dá)的影響

于靜，薛佳，胡艷欣，汪明
（中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，北京海淀100193）

摘要：為研究小鼠在急性熱應(yīng)激條件下肺組織中幾種熱應(yīng)激蛋白（heat shock proteins，HSPs）及一些細(xì)胞因子基因表達(dá)水平的變化情況，通過(guò)實(shí)時(shí)熒光定量PCR的方法檢測(cè)小鼠急性熱應(yīng)激前后肺組織中HSP27、HSP60、HSP70、HSP90、HSP110及白細(xì)胞介素-6（IL-6）、白細(xì)胞介素-17（IL-17）、腫瘤壞死因子α（TNF-α）、β干擾素（IFN-β）及γ干擾素（IFN-γ）的mRNA水平變化情況。結(jié)果顯示，所有檢測(cè)的熱應(yīng)激蛋白和細(xì)胞因子在熱應(yīng)激后0 h至2 h過(guò)程中均極顯著升高（P<0.01），到4 h時(shí)恢復(fù)到正常水平。此試驗(yàn)結(jié)果為揭示急性熱應(yīng)激提高機(jī)體的抗病能力提供有價(jià)值的資料。

關(guān)鍵詞：熱應(yīng)激；熱應(yīng)激蛋白；細(xì)胞因子；熒光定量PCR

中圖分類號(hào)：S816.4

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號(hào)：0529- 6005（2015）10- 0020- 04

Corresponding author：WANG Ming

熱應(yīng)激，是指當(dāng)環(huán)境溫度超過(guò)動(dòng)物和人體舒適溫度（產(chǎn)熱最低點(diǎn)與蒸發(fā)散熱急劇增加起始點(diǎn)之間溫度）時(shí)，動(dòng)物和人為保護(hù)其正常的代謝作用，其各種生理機(jī)制所必須做出的各種反應(yīng)的總和。有研究表明，短暫急性應(yīng)激（27.5℃，1 h）能夠增強(qiáng)西伯利亞鱘的非特異性免疫[1]；急性熱應(yīng)激（34℃，24 h）能夠提升肉鵪鶉的抗氧化性能[2]；運(yùn)動(dòng)之前的急性熱應(yīng)激（41℃，20 min）能夠保護(hù)機(jī)體免受肌肉損傷[3]；印度的醫(yī)學(xué)文獻(xiàn)中記載，熱敷即熱應(yīng)激用于機(jī)體從寒冷、腸絞痛、僵硬、遲緩中恢復(fù)正常功能的治療。本課題組前期試驗(yàn)證明，急性熱應(yīng)激（4 h，39℃±1℃）可以顯著提高小鼠抵抗流感病毒的能力。因此，急性熱應(yīng)激提高機(jī)體抗病能力的機(jī)制成為需要進(jìn)一步闡明的問(wèn)題。

熱應(yīng)激蛋白（heat shock proteins，HSPs）分為HSP110、HSP90、HSP70、HSP60及小分子HSP和泛素等6個(gè)家族[4]。HSPs是一組在生物體中高度保守并具有重要生理功能的蛋白質(zhì)分子家族[5]。大量的研究已經(jīng)充分證明，HSPs具有分子伴侶作用及廣泛的免疫學(xué)生物活性[6-7]?？茖W(xué)家們已經(jīng)開始普遍關(guān)注HSP與機(jī)體腫瘤發(fā)生和控制、自身免疫耐受形成及自身免疫疾病發(fā)生等重大免疫學(xué)問(wèn)題的關(guān)系。此外，人們也積極地將HSP用于抗細(xì)菌、病毒、寄生蟲和腫瘤新型疫苗的研制當(dāng)中，并取得了一系列可喜的成果。

細(xì)胞因子（cytokine，CK）即主要由免疫細(xì)胞分泌的、能調(diào)節(jié)細(xì)胞功能的小分子肽。主要參與調(diào)節(jié)免疫應(yīng)答及炎癥反應(yīng)，刺激造血功能，參與組織修復(fù)等。當(dāng)細(xì)胞因子與相應(yīng)受體結(jié)合后，能通過(guò)靶細(xì)胞膜上的相應(yīng)受體將信息傳遞到細(xì)胞核內(nèi)，激活或抑制某些轉(zhuǎn)錄因子，從而誘導(dǎo)新蛋白的合成。這些新合成的蛋白發(fā)揮其生物學(xué)功能，形成免疫網(wǎng)絡(luò)以保證機(jī)體的正常免疫應(yīng)答及維持機(jī)體的平衡。

本試驗(yàn)通過(guò)研究急性熱應(yīng)激后小鼠肺組織內(nèi)各種熱應(yīng)激蛋白和一些細(xì)胞因子基因表達(dá)的變化，為揭示急性熱應(yīng)激提高機(jī)體抗病毒能力的機(jī)制提供有價(jià)值的資料。

1　材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物小鼠：體重20 g左右6～8周齡雌性BALB/C小鼠，購(gòu)自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司。

1.2小鼠的急性熱應(yīng)激與采樣將小鼠放于鼠籠中，鼠籠置于39℃±1℃溫箱中熱應(yīng)激4 h，取出，在0 h，0.5 h，1 h，2 h，4 h 5個(gè)時(shí)間點(diǎn)頸椎脫臼處死，取米粒大小肺組織放入凍存管中，置于液氮中保存待用。

1.3熒光定量PCR法測(cè)定基因表達(dá)情況

1.3.1引物的設(shè)計(jì)根據(jù)GenBank上發(fā)表的序列，應(yīng)用Primer Premier5.0設(shè)計(jì)熒光定量PCR引物（見(jiàn)表1），引物由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。

表1　熒光定量PCR法所用引物

1.3.2反應(yīng)條件95℃10 min；95℃15 s，50℃30 s，72℃45 s（讀板）共40個(gè)循環(huán)。

1.4數(shù)據(jù)的分析處理本試驗(yàn)采用2-ΔΔCt法對(duì)細(xì)胞因子基因進(jìn)行相對(duì)定量分析，選β-actin為內(nèi)參基因[8-9]。用SPSS 10.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行差異顯著性分析，P<0.05為差異顯著；P<0.01為差異極顯著。用GraphPad Prism 5.0醫(yī)學(xué)繪圖軟件對(duì)測(cè)得的數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)作圖。

2　結(jié)果與分析

2.1急性熱應(yīng)激對(duì)小鼠肺組織HSPs基因表達(dá)的影響如圖1所示，39℃±1℃熱應(yīng)激4 h后，小鼠肺組織中各種熱應(yīng)激蛋白（HSP27，HSP60， HSP70，HSP90，HSP110）的表達(dá)量在零點(diǎn)時(shí)即呈現(xiàn)高表達(dá)，持續(xù)到2 h其表達(dá)量均極顯著高于對(duì)照組小鼠（P<0.01），到4 h時(shí)降低到正常水平。

2.2急性熱應(yīng)激對(duì)小鼠肺組織細(xì)胞因子表達(dá)的影響如圖2所示，39℃±1℃熱應(yīng)激4 h后，小鼠肺組織中IL-6, IL-17, TNF-α，IFN-β及IFN-γ的表達(dá)量均有所上升。其中，IL-6，IFN-β及IFN-γ的表達(dá)量在零點(diǎn)時(shí)即呈現(xiàn)高表達(dá)，在0.5 h表達(dá)量有所下降，而1 h后表達(dá)量大幅上升，持續(xù)到2 h其表達(dá)量均極顯著高于對(duì)照組小鼠（P<0.01），到4 h降低到正常水平；IL-17和TNF-α的表達(dá)情況雖然較對(duì)照組而言上升顯著（P<0.05），但較其他細(xì)胞因子而言不夠穩(wěn)定，上升幅度較小。

3　討論

HSPs在炎癥中有保護(hù)作用，當(dāng)病原體侵入宿主后，可引起巨噬細(xì)胞吞噬，高濃度活性氧族（ROS）產(chǎn)生，淋巴細(xì)胞釋放細(xì)胞因子IL-1、IL-2、IL-8及TNF等，ROS及細(xì)胞因子上調(diào)HSPs，激活HSPs基因，增強(qiáng)HSPs的表達(dá)；反過(guò)來(lái)，HSPs通過(guò)抑制ROS及細(xì)胞因子起到保護(hù)細(xì)胞和組織免疫炎癥損傷的作用[10]。本試驗(yàn)結(jié)果顯示，在急性熱應(yīng)激后，小鼠肺組織中多種HSPs的基因表達(dá)均有顯著上升，能夠加強(qiáng)機(jī)體對(duì)炎癥的保護(hù)作用。

IL-6能誘導(dǎo)B細(xì)胞分化并產(chǎn)生免疫球蛋白、激活NK細(xì)胞、加速肝細(xì)胞急性期蛋白的合成、能被IL-1β和TNF-α誘導(dǎo)表達(dá)，同時(shí)又能在炎癥反應(yīng)中起調(diào)節(jié)作用，抑制IL-1β和TNF-α的過(guò)度表達(dá)，兼有促炎及抗炎作用[11]。IL-17是一種主要由活化的T細(xì)胞產(chǎn)生的致炎細(xì)胞因子，可以促進(jìn)T細(xì)胞的激活和刺激上皮細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、成纖維細(xì)胞產(chǎn)生多種細(xì)胞因子從而導(dǎo)致炎癥的產(chǎn)生。TNF-α是經(jīng)典的促炎因子，能促進(jìn)局部和全身的炎性反應(yīng)，有類似IFN的抗病毒作用，可促進(jìn)CTL表達(dá)MHC-I類抗原并增強(qiáng)CTL對(duì)病毒感染細(xì)胞的殺傷作用[12-13]。IFN-β具有廣譜抗病毒作用及免疫調(diào)節(jié)作用，能促進(jìn)大多數(shù)MHC I類抗原的表達(dá)，活化NK細(xì)胞和CTL，能抑制和殺傷腫瘤細(xì)胞[14]。IFN-γ是最重要的Th2型細(xì)胞因子，又稱II型干擾素，主要由T細(xì)胞和NK細(xì)胞產(chǎn)生，可以誘導(dǎo)單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞及成纖維細(xì)胞等MHC II類抗原的表達(dá)，使其參與抗原提呈和特異性免疫的識(shí)別過(guò)程，能夠促進(jìn)巨噬細(xì)胞FcγR的表達(dá)并促進(jìn)巨噬細(xì)胞殺傷病原微生物，并協(xié)同IL-2共同誘導(dǎo)淋巴細(xì)胞活化殺傷細(xì)胞（Lympho?kine active killer cells，LAK）的殺傷活性，促進(jìn)T細(xì)胞表達(dá)IL-2R[15]。這些細(xì)胞因子的高表達(dá)有利于病毒感染時(shí)機(jī)體對(duì)病毒粒子的清除，能夠起到保護(hù)機(jī)體抵抗病毒感染的作用。

圖1　急性熱應(yīng)激對(duì)小鼠肺組織中熱應(yīng)激蛋白表達(dá)的影響

綜上所述，本試驗(yàn)通過(guò)檢測(cè)急性熱應(yīng)激后小鼠肺組織內(nèi)多種HSPs和細(xì)胞因子的表達(dá)情況，揭示了急性熱應(yīng)激提高機(jī)體對(duì)病毒抵抗力可能與刺激多種熱應(yīng)激蛋白及相關(guān)抗病毒細(xì)胞因子的上調(diào)表達(dá)有關(guān)，為進(jìn)一步研究急性熱應(yīng)激保護(hù)機(jī)體的機(jī)制奠定了基礎(chǔ)。

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圖2　急性熱應(yīng)激對(duì)小鼠肺組織中細(xì)胞因子表達(dá)的影響

Theeffects of acuteheat stress on geneexpression of several HSPs and cytokines in lung tissueof mice

YU Jing，XUE Jia，HU Yan-xin，WANG Ming
（College of Veterinary Medicine，China Agriculture University，Beijing 100193，China）

Abstract：The purpose of this study is to analyze the changes of several heat shock proteins（HSPs）and cytokines under the condition of acute heat stress in a mouse model.The changes of heat shock proteins（HSP27，HSP60，HSP70，HSP90 and HSP110）and cytokines（IL-6，IL-17，TNF-α，IFN-β and IFN-γ）before and after heat stress in the lung were determined by the method of RT-PCR on mRNA level .The results showed that the expression of the HSPs and cytokines were up-regulated after acute heat stress.These results will provide valuable information for the study of the protective roles of acute heat stress.

Key words：heat stress；Heat Shock Proteins；cytokines；Real Time PCR

通訊作者：汪明，E-mail：vetdean@cau.edu.cn

作者簡(jiǎn)介：于靜（1989-），女，碩士生，從事預(yù)防獸醫(yī)學(xué)研究，E-mail：yujing19891029@126.com

收稿日期：2014-07-14