鄭　鍇，朱杭飛，王長文，郭素紅，李正祎，藏雨軒，張雲(yún)喬，鄭　巖，方　芳，郝　峰（.吉林醫(yī)藥學(xué)院檢驗(yàn)學(xué)院，吉林吉林303；.吉林醫(yī)藥學(xué)院公共衛(wèi)生學(xué)院，吉林吉林303）

YFP- H148Q/I152L在FRT細(xì)胞中的表達(dá)及其對碘離子敏感特性的研究

鄭鍇1，朱杭飛1，王長文2，郭素紅1，李正祎1，藏雨軒1，張雲(yún)喬1，鄭巖1，方芳1，郝峰1
（1.吉林醫(yī)藥學(xué)院檢驗(yàn)學(xué)院，吉林吉林132013；2.吉林醫(yī)藥學(xué)院公共衛(wèi)生學(xué)院，吉林吉林132013）

摘要：為探討YFP-H148Q/I152L在FRT細(xì)胞中的表達(dá)及其對碘離子的敏感性，應(yīng)用點(diǎn)突變試劑盒將真核表達(dá)載體YFP特異編碼序列第148位氨基酸H突變?yōu)镼，第152位氨基酸I突變?yōu)長，脂質(zhì)體介導(dǎo)將YFP-H148Q/I152L轉(zhuǎn)染入穩(wěn)定表達(dá)Ano2的FRT細(xì)胞中，應(yīng)用熒光淬滅動力學(xué)試驗(yàn)檢測YFP-H148Q/I152對其碘離子的敏感性。測序結(jié)果證實(shí)，成功將YFP突變?yōu)閅FP-H148Q/I152L，且熒光淬滅動力學(xué)試驗(yàn)表明，表達(dá)YFP-H148Q/I152L的FRT細(xì)胞在加入激活劑和碘離子后，相對熒光強(qiáng)度顯著下降。表明成功構(gòu)建YFP-H148Q/I152L真核表達(dá)載體，并證實(shí)表達(dá)于FRT胞漿中的YFPH148Q/I152L具有對碘離子敏感的特性。

關(guān)鍵詞：YFP-H148Q/I152L；FRT細(xì)胞；相對熒光強(qiáng)度

Corresponding author：HAO Feng

目前，熒光蛋白具有穩(wěn)定性好、耐受性強(qiáng)和無毒害等優(yōu)點(diǎn)[1]，成為在揭示分子或細(xì)胞活動規(guī)律和本質(zhì)的一個(gè)精確工具[2]。Ano2是表達(dá)在細(xì)胞膜上的一種鈣激活氯離子通道，能轉(zhuǎn)運(yùn)鹵族元素[3]。研究認(rèn)為Ano2是治療囊性纖維化、高血壓和哮喘等[3-4]疾病的藥物靶點(diǎn)。氯離子通道的檢測方法有很多，如膜片鉗技術(shù)和熒光染料等。膜片鉗被稱為研究氯離子通道的金標(biāo)準(zhǔn)，但它不能高通量篩選和價(jià)格十分昂貴等缺點(diǎn)[5]。熒光染料是一種消耗品，易發(fā)生熒光漂白等現(xiàn)象[6]。因此，本試驗(yàn)構(gòu)建YFP-H148Q/I152L真核表達(dá)載體，驗(yàn)證其具有對FRT細(xì)胞中碘離子敏感的特性，對氯離子通道開放情況與調(diào)節(jié)劑篩選等研究奠定了重要的基礎(chǔ)。

1　材料與方法

1.1材料YFP-pRSETB和pcDNA3.1，由麻彤輝教授饋贈；QuickchangeTM點(diǎn)突變試劑盒，購自Stratagene公司；穩(wěn)定表達(dá)pEGFP-Ano2的FRT細(xì)胞，由實(shí)驗(yàn)室保存；倒置熒光顯微鏡，購自Nikon公司；Fluostar多功能酶標(biāo)儀，購自德國BMG公司。

1.2重組載體YFP-pcDNA3.1的構(gòu)建和鑒定將YFP-pRSETB和pcDNA3.1載體為模板，PCR擴(kuò)增和瓊脂糖凝膠電泳試驗(yàn)，分別用Hind III和EcoR V雙酶切PCR產(chǎn)物，運(yùn)用DNA凝膠回收試劑盒進(jìn)行雙酶切后產(chǎn)物回收，Nanodrop 2000分光光度計(jì)測定。利用T4連接酶將載體pcDNA3.1和目的基因YFP按1∶3比例4℃作用12 h。將YFP-pcDNA3.1進(jìn)行轉(zhuǎn)化并提取質(zhì)粒，DNA瓊脂糖凝膠電泳檢測正確后，送于上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司測序。

1.3YFP-H148Q/I152L真核表達(dá)載體的構(gòu)建根據(jù)GenBank查詢YFP的特異編碼區(qū)序列（GQ22-1700.1），設(shè)計(jì)引物，將第442-444位的堿基CAC突變?yōu)閴A基CAG，第454-456位堿基ATC突變?yōu)閴A基CTG則sense：5′- CTACAACAGCCAGAACGTCTATCTGATGGCCGACAAGCAGAA-3′，antisense：5′- TGTCGGCCATCAGATAGACGTTCTGGCTGTTGTGTTGTACT-3′。以重組載體YFP-pcDNA3.1為模板進(jìn)行PCR試驗(yàn)以合成YFP-H148Q/I152L。此時(shí)所用的DNA聚合酶為具有高保真能力的pfu DNA聚合酶。運(yùn)用DNA瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行分離檢測正確后，取2 μL PCR產(chǎn)物、1 μL DpnI、5 μL 10× Buffer 4 μL和42 μL超純水，在37℃的恒溫水浴鍋中酶切4 h。YFP-H148Q/I152的轉(zhuǎn)化、質(zhì)粒提取和測序步驟與上述大致相同，只是DH5α改為QuickchangeTM點(diǎn)突變試劑盒中E.coli XL1-Blue。

1.4YFP-H148Q/I152L轉(zhuǎn)染入FRT細(xì)胞將含0.5 μg YFP-H148Q/I152L的基本培養(yǎng)液與含2.5 μL脂質(zhì)體Lipofectamine LTX的基本培養(yǎng)液混勻轉(zhuǎn)染入狀態(tài)良好鋪滿96孔板的單層FRT細(xì)胞中，6 h后棄去基本培養(yǎng)液，加入完全培養(yǎng)液，48 h后在倒置熒光顯微鏡下觀察結(jié)果。

1.5熒光淬滅動力學(xué)試驗(yàn)將狀態(tài)均一良好并已表達(dá)YFP-H148Q/I152L的FRT細(xì)胞，用PBS洗滌3次，最后1次留50 μL PBS于96孔板中，利用Fluostar多功能酶標(biāo)儀加入200 μmol/L carbachol 和120 μL不同濃度的I-溶液，并檢測相對熒光強(qiáng)度。未加carbachol的NaI溶液和加入含Ano2抑制劑NFA（200 μmol/L）的NaI溶液作為對照。

2　結(jié)果與分析

2.1YFP-H148Q/I152L酶切結(jié)果重組載體YFPH148Q/I152L進(jìn)行Hind III/EcoR V雙酶切，瓊脂糖凝膠電泳得到2條清晰的條帶，分別為720 bp和5 597 bp左右，則表明成功構(gòu)建黃色熒光蛋白雙突變體YFP-H148Q/I152L（圖1）。

圖1　YFP- H148Q/I152L酶切結(jié)果

2.2YFP-H148Q/I152L blast結(jié)果和測序結(jié)果

Blast結(jié)果顯示，YFP的第148位的H變?yōu)镼和第152位的I變?yōu)長（見中插彩版圖2A）。測序結(jié)果顯示，本試驗(yàn)構(gòu)建的重組載體YFP-H148Q/I152L第519-521位堿基為CAG，第531-533位堿基為CTG（見中插彩版圖2B）。Blast結(jié)果和測序結(jié)果均表明，將YFP成功突變?yōu)閅FP-H148Q/I152L。

2.3YFP-H148Q/I152轉(zhuǎn)染入已穩(wěn)定表達(dá)Ano2的FRT細(xì)胞前期試驗(yàn)，已將Ano2轉(zhuǎn)染入FRT細(xì)胞中，在明視野（見中插彩版圖3A）和暗視野下（見中插彩版圖3B）觀察，結(jié)果顯示，F(xiàn)RT細(xì)胞膜上表達(dá)綠色熒光，則證實(shí)FRT細(xì)胞已穩(wěn)定表達(dá)Ano2。將YFP-pcDNA3.1轉(zhuǎn)染入FRT細(xì)胞中，倒置熒光顯微鏡下觀察到FRT胞漿中表達(dá)黃色熒光，則證實(shí)FRT胞漿中表達(dá)黃色熒光蛋白雙突變體YFPH148Q/I152（見中插彩版圖3C）。

2.4熒光淬滅動力學(xué)試驗(yàn)結(jié)果加入Carbachol 和NaI溶液，結(jié)果表明，F(xiàn)RT細(xì)胞中相對熒光強(qiáng)度顯著下降（圖4A）。未加Carbachol的NaI溶液和加入含Ano2的NFA的NaI溶液，其相對熒光強(qiáng)度不變（圖4B）。本試驗(yàn)結(jié)果證實(shí)，F(xiàn)RT胞漿中的具有對碘離子敏感的特性。

圖4　熒光淬滅動力學(xué)試驗(yàn)結(jié)果

3　討論

氯離子是細(xì)胞外含量最多的陰離子，能夠調(diào)節(jié)氯離子的動態(tài)平衡和液體運(yùn)輸?shù)萚7]。PCR定點(diǎn)突變技術(shù)為目前實(shí)驗(yàn)室中改造基因常用手段之一。定點(diǎn)突變技術(shù)可應(yīng)用于改造蛋白的活性和基因治療等方面[8]?？傊?，本試驗(yàn)成功構(gòu)建黃色熒光蛋白雙突變體YFP-H148Q/I152L重組載體，并表達(dá)于FRT胞漿中，同時(shí)證實(shí)YFP-H148Q/ I152L在FRT胞漿中表達(dá)具有對碘離子敏感的特性，為研究鈣激活氯離子通道的開放情況與調(diào)節(jié)劑的篩選提供一個(gè)精確的檢測工具，對氯離子通道開放情況與調(diào)節(jié)劑篩選的研究奠定了重要的基礎(chǔ)。

參考文獻(xiàn)：

[1] Pan Y，Leifert A，Graf M，et al . High- Sensitivity Real- Time Analysis of Nanoparticle Toxicity in Green Fluorescent Protein-Expressing Zebrafish[J].Small，2013，9（6）：863-869.

[2] Shirmanova M V，Serebrovskaya E O，Lukyanov K A，et al.Photo?toxic effects of fluorescent protein KillerRed on tumor cells in mice[J].Journal of biophotonics，2013，6（3）：283-290.

[3] Galindo B E，Vacquier V D . Phylogeny of the TMEM16 protein family：some members are overexpressed in cancer[J] . Int J Mol Med，2005，16（5）：919-924.

[4] Verkman A S，Galietta L J.Chloride channels as drug targets[J]. Nat Rev Drug Discov，2009，8（2）：153-171.

[5] Katz Y，Yizhar O，Staiger J，et al.Optopatcher-An electrode hold?er for simultaneous intracellular patch-clamp recording and opti?cal manipulation[J] . Journal of neuroscience methods，2013，214 （1）：113-117.

[6] Kornreich B G.Vet Cardiol[J].The patch clamp technique：princi?ples and technical considerations，2007 May；9（1）：25-37.

[7] Huang F，Wong X，Jan LY.International Union of Basic and Clin?ical Pharmacology[J] . LXXXV：calcium-activated chloride chan?nels. Pharmacol Rev，2012 Jan；64（1）：1-15.

[8]王鵬，張熙艷，時(shí)建立，等.PCV2 Rep蛋白N-糖基化位點(diǎn)突變及其真核表達(dá)載體的構(gòu)建[J] .中國獸醫(yī)雜志，2014，50 （1）：24-26.

Expression of YFP- H148Q/I152L in FRT cells and investigation of iodineion sensitivity

ZHENG Kai1，ZHU Hang-fei1，WANG Chang-wen2，GUO Su-hong1，LI Zheng-yi1，ZANG Yu-xuan1，ZHANG Yun-qiao1，ZHENG Yan1，F(xiàn)ANG Fang1，HAO Feng1
（1.Department of Medicine Laboratory，Jilin Medical College，Jilin 132013，China；2.Department of Public Health，Jilin Medical College，Jilin 132013，China）

Abstract：To investigate the expression of YFP-H148Q/I152L in FRT cells and its property to iodine ion sensitivity.Methods: The QuickChange Site-Directed Mutagenesis Kit was applied and then the YFP-pcDNA3.1 of the 148th amino acids as H was mu?tated into Q and the 152th amino acids as I was mutated into L . The eukaryotic expression vectors of YFP-H148Q/I152L were transfected into FRT cells with expressed Ano2 by liposome.The iodine ion sensitivity of YFP-H148Q/I152L was detected by the test of kinetics of fluorescence quenching .Results：The results of sequencing indicated that YFP was mutated into YFP-H148Q/ I152L.The results of the test of kinetics of fluorescence quenching indicated that in FRT cells added activator and iodine ion，the relative fluorescence intensity of YFP-H148Q/I152L was significantly decreased . Conclusions：The eukaryotic vector of YFPH148Q/I152L was successfully established and it was confirmed that the expressed YFP-H148Q/I152L in FRT cytoplasms was sen?sitive to iodine ion.

Key words：YFP-H148Q/I152L；FRT cells；relative fluorescence intensity

通訊作者：郝峰，E-mail：haof863@126.com

作者簡介：鄭鍇（1980-），女，講師，碩士，研究方向?yàn)槁入x子通道，E-mail：carane@163.com

基金項(xiàng)目：吉林省教育廳基金資助課題（2013-351）；2014年吉林省大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練計(jì)劃；2013年吉林省大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練計(jì)劃；吉林醫(yī)藥學(xué)院大學(xué)生科研基金資助課題（吉醫(yī)學(xué)科字[2012]第12號）；國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（81202031）

收稿日期：2014-09-19

中圖分類號：Q785.786，Q256

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號：0529- 6005（2015）10- 0011- 03