李晶，劉穎，劉斌，羅永偉，范穎，馬原源，毛文靜，李世英

血管性癡呆大鼠海馬齒狀回神經(jīng)前體細(xì)胞增殖的動態(tài)變化及養(yǎng)血清腦顆粒的影響

李晶，劉穎，劉斌，羅永偉，范穎，馬原源，毛文靜，李世英

[摘要]目的觀察血管性癡呆(VD)大鼠海馬齒狀回(DG)神經(jīng)前體細(xì)胞(NPCs)增殖的動態(tài)變化及養(yǎng)血清腦顆粒的影響。方法72只Sprague-Dawley大鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組(n=24)、VD模型組(模型組, n=24)和養(yǎng)血清腦顆粒治療組(治療組, n=24)，采用改良的Pulsinelli四血管阻斷法制作VD大鼠模型。分別在造模術(shù)后1、2、4和8周采用Western blotting法檢測Nestin的表達(dá)水平，用免疫熒光法觀察海馬齒狀回區(qū)5-溴脫氧尿嘧啶(BrdU)和BrdU/Nestin的表達(dá)。結(jié)果模型組和治療組各時(shí)間點(diǎn)大鼠Nestin、BrdU和BrdU/Nestin表達(dá)持續(xù)增多，4周時(shí)達(dá)高峰。與假手術(shù)組比較，模型組各時(shí)間點(diǎn)Nestin、BrdU和BrdU/Nestin表達(dá)明顯增多(P< 0.01)；與模型組比較，治療組各時(shí)間點(diǎn)Nestin、BrdU和BrdU/Nestin表達(dá)明顯增多(P<0.01)。結(jié)論養(yǎng)血清腦顆?？纱龠M(jìn)VD大鼠海馬齒狀回區(qū)NPCs增殖。

[關(guān)鍵詞]血管性癡呆；神經(jīng)前體細(xì)胞；增殖；齒狀回；海馬；養(yǎng)血清腦顆粒

[本文著錄格式]李晶，劉穎，劉斌，等.血管性癡呆大鼠海馬齒狀回神經(jīng)前體細(xì)胞增殖的動態(tài)變化及養(yǎng)血清腦顆粒的影響[J].中國康復(fù)理論與實(shí)踐, 2015, 21(9): 1025-1030.

CITED AS: Li J, Liu Y, Liu B, et al. Proliferation of neural precursor cells in dentate gyrus of hippocampus and effect of Yangxue Qingnao Granule in vascular dementia rats [J]. Zhongguo Kangfu Lilun Yu Shijian, 2015, 21(9): 1025-1030.

血管性癡呆(vascular dementia, VD)是發(fā)生在腦血管疾病基礎(chǔ)上的以記憶、認(rèn)知功能缺損為主的獲得性智力持續(xù)性損害[1]。目前，在VD的發(fā)病機(jī)制和診斷方面取得了一定進(jìn)展，但在治療方面尚無重大突破[2-4]。養(yǎng)血清腦顆粒是根據(jù)中醫(yī)藥理論，以中醫(yī)傳統(tǒng)名方四物湯為基礎(chǔ)改良而成的中藥復(fù)方制劑，具有滋陰養(yǎng)血、平肝潛陽、活血通絡(luò)的功效[5]，臨床上應(yīng)用養(yǎng)血清腦顆粒能明顯改善VD患者認(rèn)知功能和日常生活能力[6]，但其具體作用機(jī)制尚不明確。巢蛋白(Nestin)是哺乳動物神經(jīng)系統(tǒng)先祖細(xì)胞中的一種主要細(xì)胞骨架蛋白，在成年大鼠及成人腦內(nèi)廣泛存在，為神經(jīng)前體細(xì)胞(neural precursor cells, NPCs)的標(biāo)記物[7-9]。本研究通過檢測大鼠海馬齒狀回(dentate gyrus, DG)Nestin、5-溴脫氧尿嘧啶(5-bromodeoxyuridine, BrdU)的表達(dá)，觀察VD大鼠海馬齒狀回NPCs增殖的動態(tài)變化及養(yǎng)血清腦顆粒對其表達(dá)的影響，探討?zhàn)B血清腦顆粒治療VD的可能作用機(jī)理。

1　材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動物與器材

健康雄性Sprague-Dawley(SD)大鼠72只，體質(zhì)量250～280 g，3月齡，由北京華阜康生物科技股份有限公司供給，合格證號SCXK(京)2013-0013。在華北理工大學(xué)屏障環(huán)境動物實(shí)驗(yàn)室自由進(jìn)食喂養(yǎng)，室溫(23± 2)℃，自然光照，實(shí)驗(yàn)前適應(yīng)喂養(yǎng)2周。

養(yǎng)血清腦顆粒，國藥準(zhǔn)字Z10960082，批號130366：天津天士力制藥股份有限公司。山羊血清封閉液、多聚賴氨酸溶液：北京博奧森生物技術(shù)公司。兔抗大鼠Nestin抗體：Eter Life公司。小鼠抗BrdU抗體：BD公司。DyLigh?488標(biāo)記羊抗鼠IgG和DyLigh ?594標(biāo)記羊抗兔IgG：KPL公司。

低溫離心機(jī)：SIGMA公司。電凝儀：張家港航天醫(yī)療電器有限公司。切片機(jī)：上海億欣生物科技有限公司。Morris水迷宮：淮北正華生物儀器設(shè)備有限公司。

1.2方法

1.2.1動物分組

將大鼠編號，用隨機(jī)數(shù)生成器隨機(jī)抽取不同數(shù)字，將大鼠分為假手術(shù)組、VD模型組(模型組)和養(yǎng)血清腦顆粒治療組(治療組)，在模型制備成功后又隨機(jī)分為造模術(shù)后1周、2周、4周和8周4個(gè)亞組，每個(gè)亞組6只。

1.2.2模型制備

采用改良的Pulsinelli四血管阻斷(4-VO)法制作VD大鼠模型[10]。術(shù)前禁食12 h，10%水合氯醛350 mg/kg腹腔注射麻醉，背側(cè)行頸正中切口，暴露雙側(cè)第一頸椎橫突小孔。將直徑0.5 mm的電凝針插入雙側(cè)翼小孔燒灼雙側(cè)椎動脈。大鼠仰臥位固定，行腹側(cè)頸正中切口，分離雙側(cè)頸總動脈，以4號絲線穿線。24 h后用微動脈夾夾閉雙側(cè)頸總動脈5 min，共夾閉3次，每次間隔1 h?？p合切口。繼續(xù)常規(guī)飼養(yǎng)觀察。假手術(shù)組操作步驟同上，但不燒灼和夾閉血管。術(shù)后大鼠予慶大霉素1×104U/kg腹腔注射，連續(xù)3 d。

1.2.3給藥方法

造模成功后灌胃給藥，每日1次。假手術(shù)組、模型組予生理鹽水10 ml/kg；治療組將養(yǎng)血清腦顆粒用蒸餾水配成0.32 g/ml混懸液，10 ml/kg灌胃[11]。連續(xù)給藥1、2、4、8周。

1.3學(xué)習(xí)記憶能力測定

大鼠分別于灌胃給藥后1、2、4、8周行Morris水迷宮試驗(yàn)，觀察穿越平臺次數(shù)。

1.4BrdU標(biāo)記

大鼠處死前1 d腹腔注射%生理鹽水溶液50 mg/ kg (10 g/L)，注射3次，間隔4 h；取腦前2 h注射第4次。

1.5Western blotting檢測

Morris水迷宮試驗(yàn)后，大鼠10%水合氯醛350 mg/kg腹腔注射麻醉，斷頭后于冰上開顱取腦，用冷PBS漂洗殘余血，立即分離出新鮮海馬。海馬組織置于15 ml離心管中，組織勻漿機(jī)12000 r/min勻漿15 s，加入4℃預(yù)冷組織裂解液，振蕩混勻，4℃作用30 min；細(xì)胞懸液4℃12 000 r/min離心10 min，留取上清液4℃保存。

蛋白定量后分裝，用4℃PBS調(diào)蛋白濃度750 μg/ml，加入等體積上樣緩沖液，沸水煮至少5 min。等量蛋白樣品(每個(gè)泳道50μg)經(jīng)10%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酸銨凝膠電泳(sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis, SDS- PAGE)電泳分離后，以濕轉(zhuǎn)法電轉(zhuǎn)移至聚偏二氟乙烯(polyvinylidene fluoride, PVDF)膜上。轉(zhuǎn)移后的PVDF膜放入封閉液中封閉，加入兔抗大鼠Nestin一抗(1∶1000) 4℃孵育過夜。PBS洗膜，加入二抗(1∶2000)，37℃反應(yīng)1 h；洗膜，ECL顯色，膠片曝光顯影，結(jié)果用Image J軟件分析。以Nestin蛋白與β-actin蛋白的相對光密度(OD)進(jìn)行半定量分析。

1.6免疫熒光檢測

Morris水迷宮試驗(yàn)后，大鼠10%水合氯醛350 mg/kg腹腔注射麻醉，暴露心臟，左心室快速灌注鹽水100 ml，持續(xù)灌注4%多聚甲醛-PBS 100 ml，斷頭取腦，4%多聚甲醛-PBS固定過夜。冠狀面切斷包含海馬的腦組織(視交叉后)，石蠟包埋，5 μm連續(xù)切片。

免疫熒光檢測方法按照試劑盒操作說明書進(jìn)行。石蠟切片脫蠟，水化組織切片，加入正常羊血清封閉。分別加入BrdU一抗(1∶100)和Nestin一抗(1∶200)的混合液，4℃過夜。次日加入相應(yīng)二抗混合液(1∶200)，室溫避光孵育1 h，PBS洗10 min，共3次。以0.01 mol/L PBS代替一抗作為陰性對照。OLYMPUS BX53顯微鏡下觀察并拍照。應(yīng)用圖像分析系統(tǒng)計(jì)數(shù)大鼠海馬齒狀回區(qū)BrdU、BrdU/Nestin陽性細(xì)胞數(shù)。每只大鼠隨機(jī)選取海馬齒狀回區(qū)各3張切片，隨機(jī)取6個(gè)非重疊視野，取平均值。

熒光顯微鏡下，細(xì)胞核出現(xiàn)綠色顆粒者為BrdU陽性細(xì)胞，藍(lán)光激發(fā)時(shí)呈綠色的為BrdU陽性細(xì)胞，黃光激發(fā)時(shí)呈紅色的為Nestin陽性細(xì)胞。BrdU/Nestin融合后胞膜呈紅色，胞核呈綠色。

1.7統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。所得數(shù)據(jù)以(xˉ±s)表示。多組數(shù)據(jù)間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)。顯著性水平α=0.05。

2　結(jié)果

2.1一般情況

造模后4周左右，大鼠出現(xiàn)VD行為學(xué)改變，其中5只由于病情過重淘汰，另有3只死亡。均給予相應(yīng)補(bǔ)充。

2.2學(xué)習(xí)記憶能力

與假手術(shù)組比較，模型組大鼠穿越平臺次數(shù)明顯減少(P<0.01)；與模型組比較，治療組大鼠穿越平臺次數(shù)明顯增加(P<0.01)。見表1。

表1　各組大鼠穿越平臺次數(shù)比較

2.3Western blotting

假手術(shù)組各時(shí)間點(diǎn)可見少量Nestin表達(dá)。模型組各時(shí)間點(diǎn)Nestin表達(dá)增多，4周時(shí)達(dá)高峰。與假手術(shù)組相比，模型組各時(shí)間點(diǎn)Nestin表達(dá)明顯增多(P< 0.01)。治療組各時(shí)間點(diǎn)Nestin表達(dá)較模型組明顯增加(P<0.01)。見表2。

表2　各組大鼠海馬齒狀回Nestin比較(OD)

2.4免疫熒光

假手術(shù)組各時(shí)間點(diǎn)可見少量BrdU陽性細(xì)胞，呈散在分布。模型組各時(shí)間點(diǎn)BrdU陽性細(xì)胞表達(dá)增多，沿著海馬區(qū)齒狀回的顆粒下區(qū)呈線狀非連續(xù)排列，局部可見陽性細(xì)胞堆積；1周時(shí)即有多量表達(dá)，2周時(shí)大量表達(dá)，4周時(shí)達(dá)高峰，8周時(shí)開始下降但仍較高。與假手術(shù)組相比，模型組各時(shí)間點(diǎn)BrdU陽性細(xì)胞數(shù)明顯增多(P<0.01)。治療組各時(shí)間點(diǎn)BrdU陽性細(xì)胞數(shù)較模型組明顯增多(P<0.01)。見表3和圖1。

選擇增殖反應(yīng)最明顯的第4周作為觀察點(diǎn)。假手術(shù)組大鼠海馬齒狀回可見少量BrdU/Nestin陽性細(xì)胞，平均(5.00±1.79)個(gè)/高倍視野(HD)。模型組和治療組BrdU/Nestin陽性細(xì)胞數(shù)明顯增多，主要分布在顆粒細(xì)胞下層(圖2)。模型組BrdU/Nestin陽性細(xì)胞數(shù)(23.50±2.35)個(gè)/HD，較假手術(shù)組明顯增多(P<0.01)；治療組BrdU/Nestin陽性細(xì)胞數(shù)(33.50±1.87)個(gè)/HD，較模型組明顯增加(P<0.01)。

表3　各組大鼠海馬齒狀回BrdU陽性細(xì)胞數(shù)比較(/HD)

圖1　各組大鼠海馬齒狀回BrdU免疫熒光染色(400×)

圖2　各組給藥后4周大鼠海馬齒狀回BrdU/Nestin免疫熒光染色(400×)

3　討論

VD的基礎(chǔ)疾病是腦血管疾病，慢性腦缺血是VD發(fā)生的主要病因之一[12]。本研究采用的4-VO法，是目前國內(nèi)外公認(rèn)的理想的VD動物模型，已被廣泛用于VD治療的研究。Morris水迷宮測試表明，模型組大鼠跨越平臺的次數(shù)明顯減少，提示造模成功；予養(yǎng)血清腦顆粒治療，大鼠穿越平臺次數(shù)增加，表明養(yǎng)血清腦顆粒能改善VD大鼠學(xué)習(xí)記憶能力。

在成年哺乳動物及人類中樞神經(jīng)系統(tǒng)中，特別是在海馬齒狀回顆粒下層存在著具有增殖分化潛能的NPCs[13]，可分化發(fā)育成神經(jīng)元和神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞，以補(bǔ)充和替代神經(jīng)細(xì)胞的損傷和缺失，發(fā)揮內(nèi)源性修復(fù)作用[14]。

Nestin是構(gòu)成細(xì)胞骨架的一種中間絲蛋白，屬于第Ⅳ類中間絲蛋白，為Hockfield和Mckay在大鼠胚胎脊髓神經(jīng)管NPCs表達(dá)的蛋白中發(fā)現(xiàn)一種能被anti-nestin抗體特異性識別的蛋白[15]。Nestin分布在細(xì)胞質(zhì)內(nèi)，在神經(jīng)胚胎形成階段特異性表達(dá)于神經(jīng)內(nèi)皮干細(xì)胞，并在NPCs進(jìn)行神經(jīng)元終末分化后開始下降，并隨細(xì)胞成熟而停止表達(dá)。體外培養(yǎng)Nestin陽性細(xì)胞可分化出神經(jīng)元與膠質(zhì)細(xì)胞的前體細(xì)胞，常被用來作為NPCs的標(biāo)記物[8]。

BrdU是一種胸腺嘧啶脫氧核苷類似物，在細(xì)胞增殖周期的S期嵌入細(xì)胞核DNA中，可隨細(xì)胞的進(jìn)一步分裂、分化，進(jìn)入分裂后的子細(xì)胞中，直至分化成熟依然存在，并永久標(biāo)記在細(xì)胞內(nèi)[16]。BrdU陽性細(xì)胞數(shù)基本可代表腦內(nèi)NPCs的發(fā)生水平，BrdU陽性細(xì)胞被看作是具有增殖活性的細(xì)胞[17]。

本研究顯示，模型組各時(shí)間點(diǎn)大鼠海馬齒狀回區(qū)Nestin、BrdU和BrdU/Nestin表達(dá)均增多，說明VD大鼠海馬齒狀回區(qū)NPCs呈激活狀態(tài)，被誘導(dǎo)增殖分化的神經(jīng)細(xì)胞大量表達(dá)Nestin，與文獻(xiàn)報(bào)道一致[18-19]。

NPCs具有分化成神經(jīng)元和神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞的潛能，參與神經(jīng)修復(fù)過程，可能在治療各種中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病，包括神經(jīng)變性疾病、脫髓鞘病、腦血管病方面有益[20-21]。研究發(fā)現(xiàn)，增加大鼠海馬區(qū)Nestin陽性細(xì)胞對細(xì)胞具有保護(hù)作用，能促使缺血再灌注后功能恢復(fù)[22]。

養(yǎng)血清腦顆粒主要由川芎、當(dāng)歸、白芍、鉤藤、熟地黃、雞血藤、決明子、夏枯草、細(xì)辛、延胡索、珍珠母組成，在改善軟腦膜微循環(huán)、增加腦血管量、減輕腦損傷等方面具有顯著效果[23]。養(yǎng)血清腦顆粒具有養(yǎng)血活血、平肝潛陽的作用，標(biāo)本兼治，符合中醫(yī)治療VD的要求。作為現(xiàn)代中藥復(fù)方制劑，養(yǎng)血清腦顆粒具有多靶點(diǎn)、多環(huán)節(jié)、整體性調(diào)節(jié)機(jī)體的特點(diǎn)。文獻(xiàn)報(bào)道，養(yǎng)血清腦顆粒能抑制神經(jīng)細(xì)胞凋亡，保護(hù)神經(jīng)元缺血性損害[24-25]。本研究顯示，養(yǎng)血清腦顆粒治療后，大鼠海馬齒狀回區(qū)Nestin、BrdU表達(dá)增加，提示促進(jìn)VD大鼠海馬齒狀回區(qū)內(nèi)源性NPCs增殖分化，且隨著用藥時(shí)間的延長，作用更明顯。這可能是養(yǎng)血清腦顆粒發(fā)揮VD治療作用的機(jī)制之一。

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·綜述·

Proliferation of Neural Precursor Cells in Dentate Gyrus of Hippocampus and Effect of Yangxue Qingnao Granule in Vascular Dementia Rats

LI Jing, LIU Ying, LIU Bin, LUO Yong-wei, FAN Ying, MA Yuan-yuan, MAO Wen-jing, LI Shi-ying
First Department of Neurology, Hospital Affiliated to North China University of Science and Technology, Tangshan, Hebei 063000, China

Abstract:Objective To observe dynamic variation of neural precursor cells in dentate gyrus of hippocampus and effect of Yangxue Qingnao Granule on it in vascular dementia rats. Methods 72 Sprague-Dawley rats were randomly divided into sham group (n=24), vascular dementia group (model group, n=24) and Yangxue Qingnao Granule group (treatment group, n=24). The vascular dementia model was established with modified Pulsineli's four-vessel occlusion. The expression of Nestin was detected with Western blotting, the expression of 5-bromodeoxyuridine (BrdU) and BrdU/Nestin were detected with immunofluorescence in dentate gyrus of hippocampus 1, 2, 4 and 8 weeks after modeling. Results The expression of Nestin, BrdU and BrdU/Nestin increased in the model and treatment groups with time, peaked at 4 weeks after modeling, and it was more than that of the sham group on all the time points (P<0.01). However, it was more in the treatment group than in the model group on all the time points (P<0.01). Conclusion Yangxue Qingnao Granule promotes the proliferation of neural precursor cells in dentate gyrus of hippocampus in vascular dementia rats.

Key words:vascular dementia; neural precursor cells; proliferation; dentate gyrus; hippocampus; Yangxue Qingnao Granule

(收稿日期：2015-05-03修回日期：2015-07-22)

作者簡介：作者單位：華北理工大學(xué)附屬醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)一科，河北唐山市063000。李晶(1990-)，女，漢族，河北邢臺市人，碩士研究生，主要研究方向：腦血管病及認(rèn)知障礙。通訊作者：劉斌，男，碩士，主任醫(yī)師，教授，研究生導(dǎo)師。E-mail: liubintsh@126.com。

基金項(xiàng)目：1.河北省高等學(xué)校科學(xué)技術(shù)研究重點(diǎn)項(xiàng)目(No.ZH2012046)；2.河北省級重大醫(yī)學(xué)科研課題(No.zd2013087)。

DOI:10.3969/j.issn.1006-9771.2015.09.009

[中圖分類號]R743

[文獻(xiàn)標(biāo)識碼]A

[文章編號]1006-9771(2015)09-1025-06