李曉潔，林如輝，陶靜，趙從快，俞坤強(qiáng)，李春燕，彭洪衛(wèi)，陳立典

電針對(duì)腦缺血再灌注大鼠學(xué)習(xí)記憶能力及海馬組織腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子和神經(jīng)營養(yǎng)素受體p75表達(dá)的影響

李曉潔1，林如輝2，陶靜1，趙從快1，俞坤強(qiáng)1，李春燕1，彭洪衛(wèi)1，陳立典3

[摘要]目的探討電針治療腦卒中后認(rèn)知障礙的可能機(jī)制。方法45只Sprague-Dawley雄性大鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組(n=15)、模型組(n=15)和電針組(n=15)。模型組、電針組用線栓法制備左側(cè)局灶性腦缺血1.5 h再灌注模型。電針組電針神庭、百會(huì)穴7 d。采用Morris水迷宮檢測大鼠學(xué)習(xí)記憶能力；Longa評(píng)分法觀察大鼠神經(jīng)功能缺損情況；HE染色觀察大鼠海馬神經(jīng)元形態(tài)結(jié)構(gòu)變化；免疫印跡法檢測大鼠缺血側(cè)海馬組織中腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(BDNF)、神經(jīng)營養(yǎng)素受體p75 (p75NTR)蛋白表達(dá)。結(jié)果與模型組相比，電針組逃避潛伏期縮短(P<0.05)，穿越平臺(tái)次數(shù)顯著增加(P<0.001)；神經(jīng)功能缺損評(píng)分明顯減少(P<0.01)；缺血側(cè)海馬區(qū)細(xì)胞損傷較輕，BDNF表達(dá)明顯升高(P<0.01)，p75NTR蛋白表達(dá)明顯降低(P<0.01)。結(jié)論電針能夠改善腦缺血再灌注大鼠學(xué)習(xí)記憶能力，其機(jī)制可能與上調(diào)大鼠海馬組織中BDNF蛋白和下調(diào)p75NTR蛋白表達(dá)水平有關(guān)。

[關(guān)鍵詞]腦缺血再灌注；學(xué)習(xí)記憶；電針；腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子；神經(jīng)營養(yǎng)素受體p75；大鼠

[本文著錄格式]李曉潔，林如輝，陶靜，等.電針對(duì)腦缺血再灌注大鼠學(xué)習(xí)記憶能力及海馬組織腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子和神經(jīng)營養(yǎng)素受體p75表達(dá)的影響[J].中國康復(fù)理論與實(shí)踐, 2015, 21(9): 1020-1024.

CITED AS: Li XJ, Lin RH, Tao J, et al. Effects of electroacupuncture on learning and memory and expression of brain-derived neurotrophic factor and p75 neurotrophin receptor in rats with cerebral ischemia-reperfusion [J]. Zhongguo Kangfu Lilun Yu Shijian, 2015, 21(9):1020-1024.

認(rèn)知功能障礙是腦卒中后常見的功能障礙[1-2]，不僅嚴(yán)重影響感覺、運(yùn)動(dòng)等其他功能康復(fù)，而且還會(huì)嚴(yán)重影響患者的日常生活能力和生活質(zhì)量[3-4]。電針神庭、百會(huì)穴能在一定程度上改善腦卒中后認(rèn)知功能障礙，但機(jī)制尚未完全闡明[5-7]。有研究指出，腦缺血發(fā)生時(shí)，腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(brain-derived neurotrophic factor, BDNF)與神經(jīng)營養(yǎng)素受體p75(p75 neurotrophin receptor, p75NTR)結(jié)合，激活c-Jun N-末端激酶(JNK)通路，從而誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[8]，影響認(rèn)知功能。本研究觀察電針神庭、百會(huì)穴對(duì)局灶性腦缺血再灌注大鼠學(xué)習(xí)記憶能力、海馬神經(jīng)元形態(tài)結(jié)構(gòu)及海馬組織中BDNF和p75NTR蛋白表達(dá)的影響，探討電針治療腦卒中后認(rèn)知障礙的作用機(jī)制。

1　材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與分組

45只健康成年SPF級(jí)Sprague-Dawley大鼠，體質(zhì)量(280±20) g，由福建中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，許可證號(hào)：SYXK(閩)2005-004。大鼠分籠飼養(yǎng)，每籠5只。適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，用隨機(jī)數(shù)字表法將大鼠編號(hào)，分為假手術(shù)組(n=15)、模型組(n=15)和電針組(n=15)。

1.2主要實(shí)驗(yàn)試劑及儀器

線栓：廣州佳靈生物技術(shù)有限公司。BDNF一抗：ABCAM公司。p75NTR一抗：Cell Signaling Technology公司。β-actin一抗、辣根過氧化物酶二抗：全式金公司。封閉液、一抗稀釋液、二抗稀釋液：碧云天公司。

華佗牌電針治療儀：蘇州醫(yī)療用品廠有限公司。Morris水迷宮：中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥物研究所。Image-lab圖像分析系統(tǒng)：BIO-RAD公司。

1.3動(dòng)物模型制備

在室溫22℃下，大鼠稱重，參考Longa等方法，行左側(cè)大腦中動(dòng)脈阻塞(middle cerebral artery occlusion, MCAO)[9]。10%水合氯醛3 ml/kg腹腔注射麻醉，常規(guī)去毛消毒，正中切開頸部皮膚，暴露頸總動(dòng)脈，向上分離出頸內(nèi)動(dòng)脈和頸外動(dòng)脈主干；在頸內(nèi)、外動(dòng)脈分叉處結(jié)扎頸外動(dòng)脈，在近心端結(jié)扎頸總動(dòng)脈。用動(dòng)脈夾夾閉頸內(nèi)動(dòng)脈，然后在頸總動(dòng)脈結(jié)扎處遠(yuǎn)端約3 mm處剪一小口，將備好的線栓從切口導(dǎo)入。撤去頸內(nèi)動(dòng)脈血管夾，經(jīng)頸內(nèi)動(dòng)脈緩慢推入線栓至大腦前動(dòng)脈近端，約插入18～22 mm。固定線栓，縫合傷口。1.5 h后回抽線栓至頸總動(dòng)脈分叉處。試驗(yàn)過程和動(dòng)物蘇醒期間注意保暖。

假手術(shù)組只分離動(dòng)脈，不結(jié)扎、插線。

動(dòng)物蘇醒后觀察其體態(tài)及行為，不合格的動(dòng)物剔除。

1.4干預(yù)方法

電針組參考《實(shí)驗(yàn)針灸學(xué)》[10]取大鼠神庭和百會(huì)穴，應(yīng)用華佗牌SDZ-V電針儀，針具采用無磁的金合銀針，電流1～3 mA，以針體輕輕抖動(dòng)為度，疏密波，頻率2/10 Hz。造模后第2天開始，每次30 min，每天1次，共7 d。

假手術(shù)組、模型組置于普通籠中飼養(yǎng)，只給予同等條件抓取，不給予任何治療。

1.5Morris水迷宮

Morris水迷宮為直徑200 cm、高50 cm的圓形水池，水深30 cm，水溫(25±2)℃；圓形逃逸平臺(tái)直徑6 cm，低于水面2 cm，置于某一象限中央。室溫22℃，屋頂和四壁表面光滑整潔，照明設(shè)備四周對(duì)稱。各組造模后第3天開始檢測。主要包括定位航行試驗(yàn)和空間探索試驗(yàn)。

定位航行試驗(yàn)歷時(shí)4 d。大鼠自由游泳2 min以適應(yīng)環(huán)境和人的抓握等相關(guān)操作。分別從水池4個(gè)象限將大鼠面向池壁放入水中，測其在90 s內(nèi)找到平臺(tái)所需的時(shí)間(逃避潛伏期)，由計(jì)算機(jī)記錄各種參數(shù)。如果大鼠90 s內(nèi)未找到平臺(tái)，將其牽引到平臺(tái)，停留10 s，潛伏期記為90 s。

在造模后第7天撤除平臺(tái)，記錄大鼠在90 s內(nèi)穿過原平臺(tái)所在位置的次數(shù)。

1.6神經(jīng)功能缺損評(píng)分

采用Longa評(píng)分法[9]：0分，無神經(jīng)功能缺損；1分，提尾時(shí)右前肢內(nèi)收，不能完全伸展；2分，自發(fā)行走時(shí)向右側(cè)轉(zhuǎn)圈；3分，行走時(shí)身體向右側(cè)傾倒；4分，不能自發(fā)行走，有意識(shí)喪失。得分1～3分者為造模成功；不合格的動(dòng)物剔除。于造模后7 d再次評(píng)分。

1.7取材及檢測

1.7.1HE染色

麻醉下開胸，生理鹽水200 ml經(jīng)左心室快速?zèng)_洗，4%多聚甲醛(pH=7.4) 200 ml灌流固定。取腦后置入4%多聚甲醛內(nèi)4℃固定24～48 h。定位海馬區(qū)，常規(guī)脫水，石蠟包埋，冠狀切片，片厚約5 μm。二甲苯脫蠟、梯度酒精脫水，蘇木精和伊紅染色，光鏡下觀察組織病理學(xué)變化。

1.7.2蛋白免疫印跡法

取缺血側(cè)海馬組織置液氮罐中速凍，-80℃冰箱保存。取大鼠海馬組織100 mg，加入裂解液1 ml和絲氨酸蛋白酶抑制劑PMSF 10 μl，研磨均勻后靜置30 min，取上清；4℃14 000 r/min離心5 min，吸取上清，BCA測定蛋白濃度。待樣品蛋白變性后，10% SDS-PAGE電泳，轉(zhuǎn)移到PVDF膜，封閉2 h后，分別加BDNF一抗(1∶2000)、p75NTR一抗(1∶750)、β-actin一抗(1∶5000)孵育，4℃過夜；用辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗(1∶5000)室溫孵育1 h。將PVDF膜放于圖像掃描儀上，避光配置顯色液并覆蓋PVDF膜1 min，Image-lab圖像分析系統(tǒng)分析。以β-actin為內(nèi)參，計(jì)算目的蛋白相對(duì)灰度。

1.8統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 20.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析。水迷宮數(shù)據(jù)采用重復(fù)測量方差分析。神經(jīng)功能缺損評(píng)分不滿足正態(tài)性，采用Mann-Whitney U檢驗(yàn)。免疫印跡法數(shù)據(jù)滿足正態(tài)性，采用ANOVA分析。數(shù)據(jù)均以(xˉ±s)表示，顯著性水平α=0.05。

2　結(jié)果

2.1Morris水迷宮

模型組造模后逃避潛伏期時(shí)間比假手術(shù)組顯著延長(P<0.001)，電針組逃避潛伏期時(shí)間比模型組縮短(P<0.05)。見表1。與假手術(shù)組相比，模型組穿越平臺(tái)次數(shù)顯著減少(P<0.001)；與模型組相比，電針組穿越平臺(tái)次數(shù)顯著增加(P<0.001)。見表2。

表1　各組定位航行實(shí)驗(yàn)逃避潛伏期比較(s)

表2　各組大鼠空間探索實(shí)驗(yàn)穿越平臺(tái)次數(shù)比較

2.2神經(jīng)功能缺損評(píng)分

假手術(shù)組無神經(jīng)功能缺損癥狀。造模后第1天模型組及電針組均出現(xiàn)神經(jīng)功能缺損，兩組間神經(jīng)功能缺損評(píng)分無顯著性差異(P>0.05)；造模后第7天，電針組神經(jīng)功能缺損評(píng)分明顯低于模型組(P<0.01)。見表3。

表3　各組神經(jīng)功能缺損評(píng)分比較

2.3HE染色

模型組海馬CA1、CA3區(qū)神經(jīng)細(xì)胞稀少、排列疏松；殘存神經(jīng)元固縮破裂，存在空泡樣變。電針組海馬CA1、CA3區(qū)損傷較模型組輕，結(jié)構(gòu)較完整。假手術(shù)組未見病理改變(圖1)。

2.4免疫印跡法

與假手術(shù)組相比，模型組缺血側(cè)海馬組織中BDNF、p75NTR蛋白表達(dá)水平顯著升高(P<0.001)；與模型組相比，電針組大鼠缺血側(cè)海馬組織中BDNF蛋白表達(dá)水平明顯升高(P<0.01)，p75NTR蛋白表達(dá)水平明顯降低(P<0.01)。見表4。

表4　各組BDNF、p75NTR蛋白表達(dá)比較

圖1　各組大鼠海馬CA1、CA3區(qū)神經(jīng)元(HE染色，400×)

3　討論

認(rèn)知功能障礙是腦卒中后常見的功能障礙。有研究指出，由于不同的卒中亞型和診斷標(biāo)準(zhǔn)，腦卒中患者17%～92%在腦卒中后3個(gè)月存在輕度認(rèn)知障礙[11]。

臨床研究表明，電針在一定程度上能改善腦卒中后認(rèn)知障礙[12-14]。神庭為督脈、足陽明、太陽之會(huì)，百會(huì)為督脈、足太陽之會(huì)。神庭、百會(huì)穴皆屬于督脈，兩穴合用常起到開竅醒神的作用。

本研究顯示，電針能改善腦缺血再灌注大鼠神經(jīng)行為功能；HE染色觀察缺血側(cè)海馬組織中神經(jīng)細(xì)胞的溶解減少。這與前期研究結(jié)果[5-7,15]相一致，表明電針可以改善腦卒中后認(rèn)知功能障礙。

BDNF是神經(jīng)營養(yǎng)因子家族重要成員之一[16-17]，在腦中分布廣泛，位于皮質(zhì)、海馬、基底節(jié)等區(qū)域。BDNF是由Barde等于1982年首次從豬腦中分離純化出的具有促進(jìn)神經(jīng)生長活性的一種蛋白質(zhì)[18-19]。有研究表明，BDNF在腦缺血損傷中，對(duì)維持神經(jīng)元功能及抑制凋亡起著重要作用[20-21]。

p75NTR是腫瘤壞死因子受體家族中的一員[22-23]，能與神經(jīng)生長因子、BDNF等諸多神經(jīng)營養(yǎng)因子以低親和力結(jié)合[24-25]。有研究表明，腦缺血損傷時(shí)，BDNF 與p75NTR結(jié)合，激活JNK通路，引發(fā)級(jí)聯(lián)反應(yīng)，誘導(dǎo)神經(jīng)元凋亡[8]。本研究表明，電針可以明顯下調(diào)腦缺血再灌注大鼠海馬組織中p75NTR蛋白水平，從而減少BDNF與p75NTR的結(jié)合，進(jìn)而可能阻斷下游JNK通路的激活，從而抑制細(xì)胞凋亡。這可能是電針改善腦缺血再灌注大鼠學(xué)習(xí)記憶能力的機(jī)制之一。

綜上所述，電針能改善局灶性腦缺血再灌注大鼠的學(xué)習(xí)記憶能力，其作用機(jī)制可能與下調(diào)大鼠海馬組織中p75NTR蛋白水平，從而減少BDNF與其受體p75NTR的結(jié)合有關(guān)。然而，由于腦卒中后認(rèn)知功能障礙機(jī)制的復(fù)雜特性，以及電針作用的多靶點(diǎn)特性，其確切機(jī)制還需要進(jìn)一步深入研究。

[參考文獻(xiàn)]

[1] Suzuki M, Sugimura Y, Yamada S, et al. Predicting recovery of cognitive function soon after stroke: differential modeling of logarithmic and linear regression [J]. PLoS One, 2013, 8(1): e53488.

[2] Dacosta- Aguayo R, Grana M, Fernandez- Andujar M, et al. Structural integrity of the contralesional hemisphere predicts cognitive impairment in ischemic stroke at three months [J]. PLoS One, 2014, 9(1): e86119.

[3] Savva GM, Stephan BC. Epidemiological studies of the effect of stroke on incident dementia: a systematic review [J]. Stroke, 2010, 41(1): e41-e46.

[4] de Haan EH, Nys GM, Van Zandvoort MJ. Cognitive function following stroke and vascular cognitive impairment [J]. Curr Opin Neurol, 2006, 19(6): 559-564.

[5] Feng X, Yang S, Liu J, et al. Electroacupuncture ameliorates cognitive impairment through inhibition of NF-kappaB-mediated neuronal cell apoptosis in cerebral ischemia-reperfusion injured rats [J]. Mol Med Rep, 2013, 7(5): 1516-1522.

[6]陳吉祥,林浴坤,吳羽楠,等.電針對(duì)腦缺血再灌注大鼠學(xué)習(xí)記憶功能及海馬組織Nogo-A/NgR表達(dá)的影響[J].中國康復(fù)醫(yī)學(xué)雜志, 2015, 30(3): 219-223.

[7]吳羽楠,張?zhí)N,林如輝,等.電針對(duì)腦缺血再灌注大鼠學(xué)習(xí)記憶能力及RhoA蛋白表達(dá)的影響[J].中國康復(fù)理論與實(shí)踐, 2015, 21(1): 17-21.

[8] Becker EB, Howell J, Kodama Y, et al. Characterization of the c-Jun N-terminal kinase-BimEL signaling pathway in neuronal apoptosis [J]. J Neurosci, 2004, 24(40): 8762-8770.

[9] Longa EZ, Weinstein PR, Carlson S, et al. Reversible middle cerebral artery occlusion without craniectomy in rats [J]. Stroke, 1989, 20(1): 84-91.

[10]李忠仁.實(shí)驗(yàn)針灸學(xué)[M].北京:中國中醫(yī)藥出版社, 2003: 325-329.

[11] Pasi M, Poggesi A, Salvadori E, et al. Post-stroke dementia and cognitive impairment [J]. Front Neurol Neurosci, 2012, 30: 65-69.

[12] Zhao L, Zhang FW, Zhang H, et al. Mild cognitive impairment disease treated with electroacupuncture: a multi- center randomized controlled trial [J]. Zhongguo Zhen Jiu, 2012, 32 (9): 779-784.

[13] Chen XJ, Chen LF, Chen Q, et al. Effect of three-line puncture on the Governor Vessel and Bladder Meridian on head on cognitive function of vascular dementia patients [J]. Zhongguo Zhen Jiu, 2012, 32(4): 289-292.

[14] Zhang SQ, Wang YJ, Zhang JP, et al. Brain activation and inhibition after acupuncture at Taichong and Taixi: resting-state functional magnetic resonance imaging [J]. Neural Regen Res, 2015, 10(2): 292-297.

[15]林浴坤,陶靜,陳斌,等.電針對(duì)局灶性腦缺血再灌注損傷大鼠學(xué)習(xí)記憶功能的影響[J].中國康復(fù)理論與實(shí)踐, 2014, 20(9): 831-834.

[16] Huang L, Applegate PM, Gatling JW, et al. A systematic review of neuroprotective strategies after cardiac arrest: from bench to bedside (part II－comprehensive protection) [J]. Med Gas Res, 2014, 4: 10.

[17] Berretta A, Tzeng YC, Clarkson AN. Post-stroke recovery: the role of activity-dependent release of brain-derived neurotrophic factor [J]. Expert Rev Neurother, 2014, 14(11): 1335-1344.

[18] Barde YA, Edgar D, Thoenen H. Purification of a new neurotrophic factor from mammalian brain [J]. EMBO J, 1982, 1(5): 549-553.

[19] Li H, Park JH, Yan B, et al. Neuroprotection of Alpinia katsumadai Seed Extract against neuronal damage in the ischemic gerbil hippocampus is linked to altered brain- derived neurotrophic factor [J]. Lab Anim Res, 2011, 27(1): 67-71.

[20] Chen A, Xiong LJ, Tong Y, et al. The neuroprotective roles of BDNF in hypoxic ischemic brain injury [J]. Biomed Rep, 2013, 1(2): 167-176.

[21] Jain V, Baitharu I, Prasad D, et al. Enriched environment prevents hypobaric hypoxia induced memory impairment and neurodegeneration: role of BDNF/PI3K/GSK3beta pathway coupled with CREB activation [J]. PLoS One, 2013, 8(5): e62235.

[22] Longhi L, Perego C, Ortolano F, et al. Tumor necrosis factor in traumatic brain injury: effects of genetic deletion of p55 or p75 receptor [J]. J Cereb Blood Flow Metab, 2013, 33(8): 1182-1189.

[23] Esposito E, Cuzzocrea S. TNF-alpha as a therapeutic target in inflammatory diseases, ischemia- reperfusion injury and trauma [J]. Curr Med Chem, 2009, 16(24): 3152-3167.

[24] Ichim G, Tauszig- Delamasure S, Mehlen P. Neurotrophins and cell death [J]. Exp Cell Res, 2012, 318(11): 1221-1228.

[25] Bradshaw RA, Pundavela J, Biarc J, et al. NGF and ProNGF: Regulation of neuronal and neoplastic responses through receptor signaling [J].Adv Biol Regul, 2015, 58: 16-27.

·基礎(chǔ)研究·

作者單位：1.福建中醫(yī)藥大學(xué)康復(fù)醫(yī)學(xué)院，福建福州市350122；2.福建中醫(yī)藥大學(xué)中西醫(yī)結(jié)合研究院，福建福州市350122；3.福建中醫(yī)藥大學(xué)，福建福州市350122。作者簡介：李曉潔(1989-)，女，漢族，江蘇無錫市人，碩士研究生，主要研究方向：神經(jīng)康復(fù)與認(rèn)知科學(xué)研究。通訊作者：陳立典(1963-)，男，漢族，福建政和縣人，博士，教授，主要研究方向：神經(jīng)康復(fù)與認(rèn)知科學(xué)研究。E-mail: cld@fjtcm.edu.cn。

Effects of Electroacupuncture on Learning and Memory and Expression of Brain-derived Neurotrophic Factor and p75 Neurotrophin Receptor in Rats with Cerebral Ischemia-reperfusion

LI Xiao-jie1, LIN Ru-hui2, TAO Jing1, ZHAO Cong-kuai1, YU Kun-qiang1, LI Chun-yan1, PENG Hong-wei1, CHEN Li-dian3
1. Rehabilitation Medicine College, Fujian University of Traditional Chinese Medicine, Fuzhou, Fujian 350122, China; 2. Academy of Integrative Medicine, Fujian University of Traditional Chinese Medicine, Fuzhou, Fujian 350122, China; 3. Fujian University of Traditional Chinese Medicine, Fuzhou, Fujian 350122, China

Abstract:Objective To observe the effects of electroacupuncture on learning and memory, and discuss the therapeutic mechanism. Methods 45 Sprague-Dawley rats were randomly divided into sham group (n=15), model group (n=15) and electroacupuncture group (n= 15). The latter 2 groups were modeled with middle cerebral artery occlusion for 1.5 h and reperfusion. The rats of electroacupuncture group received electroacupuncture at Shenting (DU24) and Baihui (DU20) for 7 days. Learning and memory ability was tested with Morris water maze. Neurologic impairment was assessed with Longa's score. Their hippocampus were observed under HE staining and the level of brain-derived neurotrophic factor (BDNF) and p75 neurotrophin receptor (p75NTR) protein were determined with Western blotting. Results Compared with the model group, the latency of water maze decreased and the times crossing the platform increased in electroacupuncture group (P<0.05), while the Longa's score significantly reduced (P<0.05), and the lesion of nerve cells were alleviated, with the decrease of p75NTR and increase of BDNF in the ischemic hippocampus (P<0.01). Conclusion Electroacupuncture can improve the learning and memory of cerebral ischemia-reperfusion rats, which may relate with up-regulating BDNF and down-regulating p75NTR in hippocampus.

Key words:cerebral ischemia-reperfusion; learning and memory; electroacupuncture; brain-derived neurotrophic factor; p75 neurotrophin receptor; rats

(收稿日期：2015-07-23修回日期：2015-08-18)

基金項(xiàng)目：福建省康復(fù)技術(shù)協(xié)同創(chuàng)新中心資助項(xiàng)目(No.X2012004－協(xié)同)。

DOI:10.3969/j.issn.1006-9771.2015.09.008

[中圖分類號(hào)]R743.3

[文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼]A

[文章編號(hào)]1006-9771(2015)09-1020-05