何蘭英，羅勇，王健，董為偉

電刺激小腦頂核對(duì)腦缺血再灌注后大鼠腦組織損傷的影響及其機(jī)制

何蘭英1，羅勇2,3，王健1，董為偉2,3

[摘要]目的探討電刺激小腦頂核對(duì)大鼠局灶腦缺血再灌注后腦保護(hù)作用的機(jī)制。方法Sprague-Dawley大鼠分為正常對(duì)照組(NC組)、缺血再灌注組(I/R組)、缺血再灌注后小腦頂核刺激組(FNS組)、毀損小腦頂核組(FNL組)，后3組根據(jù)再灌注時(shí)間分為7 d和14 d兩個(gè)亞組，每個(gè)亞組6只。大腦中動(dòng)脈線栓法制作缺血再灌注模型。相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)采用Western blotting檢測腦梗死周圍組織核因子-κB (NF-κB) P50蛋白表達(dá)，逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)法(RT-PCR)檢測腫瘤壞死因子-α(TNF-α)和Bcl-xL mRNA表達(dá)，同時(shí)檢測各組腦梗死體積。結(jié)果與I/R組比較，F(xiàn)NS組NF-κB P50蛋白表達(dá)各時(shí)間點(diǎn)均增高(P<0.05)，TNF-α mRNA表達(dá)明顯降低(P< 0.01)，Bcl-xL mRNA表達(dá)升高(P<0.05)，梗死面積明顯減少(P<0.01)。與I/R組比較，F(xiàn)NL組上述指標(biāo)均無顯著性差異(P>0.05)。結(jié)論FNS可有效提高腦缺血再灌注后NF-κB P50蛋白、Bcl-xL mRNA表達(dá)，抑制下游炎癥因子TNF-α mRNA的表達(dá)，減小腦梗死體積，可能是FNS發(fā)揮中樞神經(jīng)保護(hù)的機(jī)制之一。

[關(guān)鍵詞]腦缺血再灌注損傷；電刺激；小腦頂核；核因子-κB；腫瘤壞死因子-α；Bcl-xL；大鼠

[本文著錄格式]何蘭英，羅勇，王健，等.電刺激小腦頂核對(duì)腦缺血再灌注后大鼠腦組織損傷的影響及其機(jī)制[J].中國康復(fù)理論與實(shí)踐, 2015, 21(9): 1012-1015.

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缺血性腦血管病是引起人類死亡的第二大疾病，也是導(dǎo)致功能殘疾的最常見疾病。腦缺血再灌注后可引起一系列反應(yīng)，導(dǎo)致神經(jīng)細(xì)胞損傷和死亡，包括一氧化氮合成，興奮性氨基酸、炎癥介質(zhì)、氧自由基生成，線粒體損傷，細(xì)胞程序性死亡以及膠質(zhì)細(xì)胞激活[1-3]。某些治療可以增加神經(jīng)細(xì)胞對(duì)缺血的耐受性，或減輕再灌注損傷，延長治療時(shí)間窗，提高再灌注損傷治療的有效性。目前，針對(duì)上述機(jī)制研發(fā)了多種神經(jīng)保護(hù)劑，但這些神經(jīng)保護(hù)劑用于臨床試驗(yàn)時(shí)，大多因無效或不良反應(yīng)而被提前終止。

近年研究證明，電刺激小腦頂核(fastigial nucleus stimulation, FNS)對(duì)中樞神經(jīng)具有廣泛的保護(hù)作用，能抑制炎癥因子的產(chǎn)生，抑制神經(jīng)細(xì)胞凋亡，促進(jìn)神經(jīng)再生，促進(jìn)神經(jīng)結(jié)構(gòu)和功能重建等[4-7]。本研究探討FNS神經(jīng)保護(hù)作用的機(jī)制。

1　材料與方法

1.1主要試劑和設(shè)備

兔抗鼠核因子-κB (factor-kappa B, NF-κB) P50多克隆抗體(SC-114)、多克隆兔抗鼠內(nèi)參β-actin抗體(SC-130657)：SANTA CRUZ公司。蛋白Marker：Fermentas公司。PVDF膜：美國ROCHE公司?？俁NA提取試劑盒：上海華舜生物工程有限公司。SDS-PAGE蛋白上樣緩沖液(5×)、SDS-PAGE凝膠配制試劑盒：碧云天生物技術(shù)研究所。RT-PCR試劑盒：大連寶生物。Gel Doc 2000凝膠成像儀、PCR儀：Bio-Rad公司。高速冷凍離心機(jī)：BECKMAN公司。紫外分光光度儀：GENEQUANT公司。

1.2實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

健康成年雄性Sprague-Dawley大鼠，體質(zhì)量250～ 300 g，重慶醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，合格證號(hào)：SCXK(渝)2007-0001。每天給予充足的食物和水，室溫22℃左右。所有實(shí)驗(yàn)操作程序嚴(yán)格遵照實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理和保護(hù)的條款執(zhí)行。

大鼠隨機(jī)分為正常對(duì)照組(NC組)、缺血再灌注組(I/R組)、缺血再灌注后小腦頂核刺激組(FNS組)，缺血再灌注后毀損小腦頂核組(FNL組)，后3組根據(jù)再灌注時(shí)間分為7 d和14 d兩個(gè)亞組，每個(gè)亞組6只大鼠。NC組不給予任何處理；I/R組夾閉右側(cè)大腦中動(dòng)脈2 h后再灌注；FNL組為預(yù)先毀損小腦頂核5 d后再行缺血再灌注，隨后行FNS治療；FNS組為在局灶腦缺血再灌注后分別給予FNS。

術(shù)中出血較多、呼吸困難、取腦時(shí)發(fā)現(xiàn)蛛網(wǎng)膜下腔出血及提前死亡者剔除，并補(bǔ)足相應(yīng)例數(shù)。

動(dòng)物蘇醒后參考Longa等的評(píng)分法評(píng)分[8]，2分或以上者入選。

1.3FNS

參照Nakai等的方法[9]，將大鼠固定在立體定位儀上，根據(jù)大鼠腦立體定向圖譜并結(jié)合鼠的大小，確定小腦頂核的位置：以前囟后緣為0點(diǎn)，正中線向后11.4～11.8 mm，旁開0.8～1.0 mm，深5.2～5.7 mm。3.5%水合氯醛1 ml/100 g腹腔注射麻醉。在大鼠顱骨上鉆1個(gè)孔，將同心圓電極插入右側(cè)小腦頂核。刺激參數(shù)：電流強(qiáng)度50 μA，頻率50 Hz，0.5 ms直角方波脈沖；持續(xù)刺激1 h。刺激過程中動(dòng)物處于淺麻醉狀態(tài)。

1.4小腦頂核毀損

定位兩側(cè)小腦頂核，用0.5 μl微量注射器分別將0.2 μl鵝膏氨酸(SIGMA公司)注入兩側(cè)小腦頂核，留針5 min緩慢拔出，縫合皮膚。5 d后行腦缺血再灌注造模。

1.5梗死體積測定

每組大鼠在再灌注后7 d、14 d，以3.5%水合氯醛1 ml/100 g腹腔注射麻醉，迅速斷頭取腦。取出全腦，置4℃0.1 mol/L PBS液中，清除表面腦膜和血塊。置于-20℃冰箱中30 min。沿視交叉冠狀切片，連續(xù)7個(gè)，片厚約2 mm。1% 2,3,5-氧化三苯基甲氮唑(TTC)溶液中37℃水浴30 min。0.01 mmol/L PBS溶液沖洗3次，4%多聚甲醛浸泡6 h后觀察腦組織顏色。正常腦組織呈均勻紅色，缺血組織呈白色。采用生物醫(yī)學(xué)圖像分析系統(tǒng)檢測腦梗死面積，根據(jù)腦切片梗死面積及切片間距離計(jì)算梗死體積。

梗死體積=∑[(S1+S2)/2×H]

其中，S1和S2為每一切片上下兩面病灶面積，H為梗死層面厚度。

1.6Western blotting

取大鼠缺血灶周圍腦組織50 mg，剪成碎片，冰浴中玻璃勻漿器勻漿；4℃1000 g離心10 min；棄上清液，沉淀物中加蛋白裂解液500 μl，冰面上裂解30 min，4℃14000 g離心10 min，取上清液，分裝后-20℃保存。Bradford法蛋白定量。取樣品至0.5 ml離心管中，加入5×SDS- PAGE蛋白上樣緩沖液至終濃度為1×。8% SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離，半干電轉(zhuǎn)移法至PVDF膜，室溫下封閉液封閉1 h。分別加入1∶500多克隆兔抗鼠P50、內(nèi)參β-actin多克隆兔抗鼠一抗，4℃孵育過夜。用相應(yīng)的抗鼠二抗(1∶750)室溫孵育2 h，化學(xué)發(fā)光法顯色，凝膠圖像處理系統(tǒng)分析目標(biāo)帶的分子量和凈光密度值，以其與β-actin比值作為代表其表達(dá)水平。

1.7RT-PCR

取大鼠缺血灶周圍腦組織50 mg，按試劑盒說明進(jìn)行總RNA提取，RT-PCR試劑盒說明進(jìn)行TNF-a和Bcl-xL mRNA表達(dá)水平的測定。引物設(shè)計(jì)：

β-actin：上游5'-GAC CCA GAT CAT GTT TGA GAC- 3'；下游5'- GCC AGG ATA GAG CCA CCA AT-3'。

TNF-α：上游5'-GTC AGC CGA TTT GCC ATT TCA- 3'；下游5'- ACA CGC CAG TCG CTT CAC AGA-3'。

Bcl-xL：上游5'-GTG CGT GGA AAG CGT AGA CA-3'；下游5'-CAG CCAAGG TGACCCATTAC-3'。

按照RT-PCR試劑盒說明進(jìn)行TNF-a和Bcl-xL反應(yīng)液體配置，按以下條件進(jìn)行PCR反應(yīng)。

TNF-α：94℃2 min，94℃30 s，55℃30 s，30個(gè)循環(huán)；72℃60 s，72℃5 min，4℃終止反應(yīng)。

Bcl-xL：94℃2 min，94℃30 s，51℃30 s，30個(gè)循環(huán)；72℃60 s，72℃5 min，4℃終止反應(yīng)。

β-actin：94℃2 min，94℃30 s，55℃30 s，30個(gè)循環(huán)；72℃60 s，72℃5 min。終止反應(yīng)。

取PCR擴(kuò)增產(chǎn)物5 μl，加入自行配制的6×上樣緩沖液1.0 μl，1.5%瓊脂糖凝膠上樣；在1×TBE緩沖液中，100 V恒壓電泳20 min；待產(chǎn)物充分電泳后，取出凝膠，Doc Gel 2000凝膠成像分析系統(tǒng)測定各條帶光密度值，以與β-actin的比值作為目的基因mRNA的相對(duì)表達(dá)量。

1.8統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

所有實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以(xˉ±s)表示，采用SPSS 17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。多組間比較采用單因素方差分析(One-Way ANOVA)分析，兩兩比較采用q檢驗(yàn)。顯著性水平α1=0.05，非常顯著性水平α2=0.01。

2　結(jié)果

2.1NF-κB P50蛋白

NC組可見NF-κB P50蛋白少量表達(dá)。各時(shí)間點(diǎn)I/ R組NF-κB P50蛋白表達(dá)較NC組明顯增加(P<0.01)。FNS組各時(shí)間點(diǎn)較I/R組NF-κB P50蛋白表達(dá)進(jìn)一步增加(P<0.05)。FNL組各時(shí)間點(diǎn)NF-κB P50表達(dá)與I/R組相比無顯著性差異(P>0.05)。見表1。

2.2TNF-α mRNA

NC組TNF-α mRNA少量表達(dá)。各時(shí)間點(diǎn)I/R組TNF-α mRNA表達(dá)較NC組明顯增加(P<0.01)。FNS組各時(shí)間點(diǎn)TNF-α mRNA表達(dá)較I/R組減少(P<0.05)。FNL組與I/R組無顯著性差異(P>0.05)。見表1。

2.3Bcl-xL mRNA

NC組Bcl-xL mRNA僅有極少量表達(dá)。各時(shí)間點(diǎn)I/R組Bcl-xL mRNA表達(dá)較NC組明顯增加(P<0.01)。FNS組表達(dá)較I/R組進(jìn)一步增加(P<0.05)。各時(shí)間點(diǎn)FNL組與I/R組無顯著性差異(P>0.05)。見表1。

表1　各組大腦NF-кB P50蛋白，TNF-a mRNA和Bcl-xL mRNA表達(dá)

2.4梗死體積

NC組腦組織呈均勻紅色，無白色梗死區(qū)；I/R組、FNS組右側(cè)腦組織均可見大腦中動(dòng)脈供血區(qū)呈白色梗死灶，左側(cè)腦組織呈均勻紅色。FNS組較I/R組顯著減少(P<0.001)，F(xiàn)NL組與I/R組無顯著性差異(P> 0.05)。見表2。

表2　各組大腦梗死體積比較(mm3)

3　討論

正常情況下，NF-κB與抑制分子IκBα非共價(jià)結(jié)合成三聚體復(fù)合物，以無活性的形式存在胞漿內(nèi)，無法進(jìn)入細(xì)胞核發(fā)揮作用。腦缺血及再灌注后，IκBα磷酸化、泛素化，最終降解，釋放游離NF-κB向細(xì)胞核內(nèi)移位，與相應(yīng)的κB位點(diǎn)結(jié)合[10-14]，迅速誘導(dǎo)靶基因轉(zhuǎn)錄。

NF-κB對(duì)神經(jīng)細(xì)胞起保護(hù)還是損傷作用，目前還不十分清楚。傷害性刺激可引NF-κB活化，從而調(diào)控其下游基因的表達(dá)[15]。在大鼠腦缺血再灌注后30 min 或1 h時(shí)，NF-κB各亞基表達(dá)明顯升高；通過抑制NF-κB活化可減少TNF-α誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡，從而提出抑制NF-κB活化可能對(duì)神經(jīng)細(xì)胞有保護(hù)作用。

目前，NF-κB在中樞神經(jīng)系統(tǒng)的保護(hù)作用也已被廣泛研究。NF-κB某亞基在中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病中調(diào)控神經(jīng)細(xì)胞存活，可能是由于激活Bcl-x、Bcl-2等表達(dá)[16]，并提出Bcl-x、Bcl-2的表達(dá)可能與NF-κB二聚體c-Rel/P50的活化有關(guān)。隨后研究發(fā)現(xiàn)，腦缺血后抑制c-Rel/P50的表達(dá)，可使Bcl-x的表達(dá)減少[17-20]。

Bcl-xL是Bcl-2家族的重要成員，是一類具有抗凋亡作用的蛋白，在維持細(xì)胞生存中起關(guān)鍵作用。Li等研究顯示，腦缺血后NF-κB的保護(hù)作用可能和NF-κB P50活化有關(guān)，敲除NF-κB P50后，神經(jīng)細(xì)胞損傷較正常組明顯加重[21]。

本研究與既往研究均證實(shí)，正常腦組織有極少量NF-кB P50蛋白、Bcl-xL和TNF-α mRNA表達(dá)；腦缺血再灌注后可誘導(dǎo)NF-κB P50以及下游因子Bcl-xL和TNF-α mRA表達(dá)。本研究發(fā)現(xiàn)，腦缺血再灌注后予FNS治療可以顯著增加NF-κB P50表達(dá)，同時(shí)伴TNF-α表達(dá)減少。Bcl-xL啟動(dòng)子中含有2個(gè)κB位點(diǎn)序列[22]。本研究顯示，F(xiàn)NS在增加NF-κB P50表達(dá)的同時(shí)，Bcl-xL的表達(dá)也相應(yīng)增加，而FNL組NF-κB P50、Bcl-xL和TNF-α mRA的表達(dá)均無明顯改變。

小腦電刺激儀采用仿生物電流，將電極置于枕后乳突進(jìn)行刺激，通過對(duì)小腦頂核的刺激作用，發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用。FNS治療可改善腦血管微循環(huán)，減輕炎癥因子的釋放，減輕神經(jīng)損傷，減少缺血區(qū)神經(jīng)元的壞死凋亡，減輕腦梗死體積，從而起到神經(jīng)保護(hù)作用，促進(jìn)神經(jīng)功能恢復(fù)，部分改善缺血再灌注損害[23-25]，已廣泛應(yīng)用于臨床。本研究表明，F(xiàn)NS可通過增加P50生成，而抑制下游炎癥因子TNF-α表達(dá)，增加抗調(diào)亡因子Bcl-xL的表達(dá)，減輕腦梗死體積，這可能是其神經(jīng)保護(hù)機(jī)制之一。

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·基礎(chǔ)研究·

作者單位：1.成都市第二人民醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，四川成都市610017；2.重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，重慶市400016；3.重慶市神經(jīng)病學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，重慶市400016。作者簡介：何蘭英(1979-)，女，漢族，四川成都市人，博士，副主任醫(yī)師，主要研究方向：缺血性腦血管病損傷及其保護(hù)機(jī)制。通訊作者：羅勇(1965-)，男，漢族，四川達(dá)州市人，研究員，博士生導(dǎo)師。E-mail: luoyong1998@163.com。

Effect of Electrical Stimulation to Cerebellar Fastigial Nucleus on Cerebral Ischemia-reperfusion Injury in Rats

HE Lan-ying1, LUO Yong2,3, WANG Jian1, DONG Wei-wei2,3
1. Department of Neurology, The Second People's Hospital of Chengdu City, Chengdu, Sichuan 610017; 2. Department of Neurology, The First Affiliated Hospital, Chongqing Medical University, Chongqing 400016, China; 3. Chongqing Key Laboratory of Neurology, Chongqing 400016, China

Abstract:Objective To investigate the effect of electrical stimulation to cerebellar fastigial nucleus on expression of nuclear factor-kappa B (NF-кB) P50, tumor necrosis factor-α(TNF-α) and Bcl-xL mRNA in rats brain after cerebral ischemia-reperfusion. Methods Sprague-Dawley rats were randomly divided into normal control group (NC group), cerebral ischemia-reperfusion group (I/R group), fastigial nucleus stimulation (FNS) group, and fastigial nucleus lesion (FNL) group. A focal cerebral ischemia-reperfusion model was established with middle cerebral artery occlusion (MCAO). 7 and 14 days after operation, the infarct volume was measured, and the protein of NF-кB P50 in rats brain was detected with Western blotting; the expression of TNF-α and Bcl-xL mRNA was detected with RT-PCR. Results Compared with I/R group, the expression of NF-кB P50 protein increased in FNS group (P<0.05), with the decrease of expression of TNF-α mRNA (P<0.01) and increase of Bcl-xL mRNA (P<0.05), while the infarct size decreased (P<0.01). There was no significant difference between FNL group and I/R group for all the measurements (P>0.05). Conclusion FNS could induce the expression of P50 protein and Bcl-xL mRNA, and inhibit the expression of TNF-α mRNA, and reduce infarct size, which may associated with the neuroprotection of central nervous system from injury.

Key words:cerebral ischemia-reperfusion; electrical stimulation; cerebellar fastigial nucleus; focal factor-kappa B; tumor necrosis factor-α; Bcl-xL; rats

(收稿日期：2015-03-28修回日期：2015-06-12)

DOI:10.3969/j.issn.1006-9771.2015.09.006

[中圖分類號(hào)]R743.3

[文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼]A

[文章編號(hào)]1006-9771(2015)09-1012-04