許文劍，劉　明，蘇秀蘭

(1.內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)附屬人民醫(yī)院普外科，呼和浩特 010020； 2.內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院 a.腫瘤外科, b.臨床醫(yī)學(xué)研究中心,呼和浩特010050)

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miR-218在大腸癌中的表達(dá)及其臨床意義

許文劍1，劉明2a※，蘇秀蘭2b

(1.內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)附屬人民醫(yī)院普外科，呼和浩特 010020； 2.內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院 a.腫瘤外科, b.臨床醫(yī)學(xué)研究中心,呼和浩特010050)

摘要：目的研究miR-218在大腸癌與正常組織中表達(dá)的差異。方法應(yīng)用實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)檢測(cè)60例大腸癌及相應(yīng)正常組織中miR-218的表達(dá)水平，計(jì)算其相對(duì)表達(dá)量。結(jié)果60例大腸癌組織中miR-218的相對(duì)表達(dá)量為0.33±0.12，顯著低于對(duì)照組， miR-218的表達(dá)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；miR-218在不同性別、年齡、腫瘤大體形態(tài)、組織學(xué)類型、臨床分期、浸潤(rùn)深度、腫瘤分化程度上表達(dá)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移較無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者表達(dá)量低(P<0.05)。結(jié)論miR-218在大腸癌中呈低表達(dá)，其表達(dá)水平越低可能提示淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移越早，miR-218 可能作為抑癌基因參與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展。

關(guān)鍵詞:大腸癌；miR-218；實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)

大腸癌是消化道常見(jiàn)惡性腫瘤之一，在惡性腫瘤致死病因中排第4位[1]，其發(fā)病率呈逐年上升的趨勢(shì)。腫瘤的復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移、擴(kuò)散仍是主要的致死原因。進(jìn)一步研究大腸癌的發(fā)病機(jī)制、尋找更加有效的治療大腸癌的方法有重要意義。研究發(fā)現(xiàn)，微RNA(miRNA)在細(xì)胞增殖、分化、凋亡、基因調(diào)控及腫瘤的發(fā)生、發(fā)展中扮演重要角色，一些miRNA作為腫瘤抑制基因參與調(diào)解，另一些miRNA則作為癌基因發(fā)揮作用。采用基因芯片技術(shù)檢測(cè)多種腫瘤組織樣本中miRNA 的表達(dá)譜, 發(fā)現(xiàn)大多數(shù)miRNA在腫瘤樣本中出現(xiàn)下調(diào)，少部分miRNA 表達(dá)水平上調(diào)。因此，對(duì)瘤中顯著表達(dá)差異的miRNA進(jìn)行生物學(xué)功能研究是有重要意義的。本研究主要分析miR-218在大腸癌中的表達(dá)及臨床意義。

1資料與方法

1.1一般資料收集2011年6月至2012年6月內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院手術(shù)切除并經(jīng)病理證實(shí)的大腸癌新鮮標(biāo)本60例作為實(shí)驗(yàn)組，相應(yīng)的正常組織標(biāo)本作為對(duì)照組，正常組織均取自腫瘤邊緣5 cm以上切緣陰性的無(wú)腫瘤組織。所有病例在術(shù)前均未接受化療或放療，并有完整的病例資料。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1RNA提取與檢測(cè)標(biāo)本離體后1 h內(nèi)取得組織樣本，迅速放入無(wú)菌無(wú)酶凍存管內(nèi)并置液氮中保存。TRIzol試劑法提取總RNA，使用DU800核酸蛋白分析儀(美國(guó)BECKMAN公司)檢測(cè)RNA水平，瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)RNA完整性。

1.2.2反轉(zhuǎn)錄互補(bǔ)DNA第一鏈合成試劑盒、miRcute miRNA熒光定量檢測(cè)試劑盒、miR-218 正向引物、反向引物(北京天根生化科技公司提供)，U6snRNA(中美泰和公司提供)。 U6正向引物： 5′-CTCGCTTCGGCAGCACA-3′； U6反向引物：5′-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3′。反應(yīng)體系：2 μg總RNA；2 μL隨機(jī)引物；2 μL 高純度 dNTP；補(bǔ)RNase-Free ddH2O定容至14.5 μL。70 ℃加熱5 min后冷卻2 min，加入以下組系：4 μL 5倍濃度的第一鏈合成緩沖液(含有DTT)；0.5 μL RNasin。加1 μL(200 U)TIAN script M-MLV;25 ℃溫浴10 min;42 ℃溫浴50 min;95 ℃加熱5 min 終止反應(yīng)，-20 ℃保存。

1.2.3聚合酶鏈反應(yīng)(polymerase chain reaction,PCR)體系及條件4 ℃條件下在0.2 mL八聯(lián)管中加入如下反應(yīng)體系：2×miRcute miRNA Premix 5 μL；50×ROX Reference Dye 0.8 μL；miR-218正向引物0.2 μL；反向引物0.2 μL；dd H2O 3.3 μL；互補(bǔ)DNA 0.5 μL，總體系10 μL。PCR反應(yīng)條件：94 ℃ 2 min，1個(gè)循環(huán)；94 ℃ 20 s，60 ℃ 34 s，50個(gè)循環(huán)。

1.2.4檢測(cè)miR-218的相對(duì)表達(dá)量應(yīng)用SYBR Green熒光定量PCR法，以U6snRNA作為內(nèi)參，檢測(cè)大腸癌組織和正常組織的miR-218的相對(duì)表達(dá)量。

miR-218表達(dá)水平計(jì)算方法為RQ(相對(duì)表達(dá)量)=2-ΔΔCt。ΔCt=Ct(miR-218)-Ct(U6)；ΔΔCt=ΔCt (癌組織)-ΔCt (正常組織)。ΔCt值越高表明miR-218表達(dá)越低。在熒光定量PCR技術(shù)中，Ct(CyC1ethreshold)值表示每個(gè)反應(yīng)管內(nèi)的熒光信號(hào)到達(dá)設(shè)定的域值時(shí)所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)。每個(gè)模板的Ct值與該模板的起始拷貝數(shù)的對(duì)數(shù)存在線性關(guān)系，起始拷貝數(shù)越多，Ct值越小。

2結(jié)果

本試驗(yàn)中擴(kuò)增曲線集中、光滑，有穩(wěn)定的平臺(tái)期，起峰位置位于20~30個(gè)ct值(圖1，圖2)，說(shuō)明本次試驗(yàn)引物的擴(kuò)增效率、特異性和模板的量都比較合適。溶解曲線集中呈單峰(圖3，圖4)。

圖1　miR-218擴(kuò)增曲線

圖2　U6擴(kuò)增曲線

圖3　miR-218溶解曲線

圖4　U6溶解曲線

在60例癌癥患者中，2例miR-218的相對(duì)表達(dá)量>1, 58例<1, 其中4例<0.5。相對(duì)表達(dá)量為0.33±0.12。正常組織與癌組織的miR-218表達(dá)倍數(shù)2-ΔΔCt差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=17.32，P=0.00)。miR-218相對(duì)表達(dá)量，除淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移外，其余各因素的不同水平間，表達(dá)量差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見(jiàn)表1。

表1　miR-218相對(duì)表達(dá)量與患者臨床病理特征的關(guān)系

3討論

通過(guò)分析更多的大腸癌患者，與非腫瘤組織相比，在大腸癌組織中miR-218的表達(dá)顯著下降。miR-218的低表達(dá)在結(jié)腸癌細(xì)胞系與正常結(jié)腸組織的對(duì)比中也被證實(shí)[2]。miR-218的下調(diào)也出現(xiàn)在其他癌癥中，包括胃癌[3-4]、神經(jīng)膠質(zhì)瘤、鼻咽癌[5]、肺癌[6]、膀胱癌[7]。人體miR-218包含兩個(gè)不同的基因(miR-218-1和miR-218-2)，它們被加工成一個(gè)相同的成熟序列的編碼。miR-218-1和miR-218-2分別鑲嵌于染色體4p15.2上的SLIT2基因和染色體5q35.1上的SLIT3基因中的內(nèi)含子區(qū)域。4p15.1~15.3區(qū)域經(jīng)常發(fā)生的缺失可導(dǎo)致大腸癌[8]。因此，在這個(gè)區(qū)域的雜合性缺失可能與大腸癌患者中miR-218的下調(diào)有關(guān)。另一方面，SLIT家族的宿主基因也常常在大腸癌中通過(guò)它們的啟動(dòng)子甲基化而被滅活[9]。有研究發(fā)現(xiàn)，在對(duì)大腸癌細(xì)胞系使用DNA甲基化抑制劑5-氮雜-2′-脫氧胞苷時(shí)，miR-218表達(dá)恢復(fù)；在鼻咽癌和口腔鱗狀細(xì)胞癌中miR-218通過(guò)啟動(dòng)子的甲基化下調(diào)表達(dá)[10-11]。這些數(shù)據(jù)表明，CpG島(雙核苷酸基因組區(qū)段)的甲基化也可能會(huì)有助于miR-218在大腸癌中沉默。在大腸癌腫瘤起源階段，下調(diào)的miR-218意味著它可能作為一個(gè)潛在的腫瘤抑制基因而發(fā)揮作用。

本研究結(jié)果顯示，大腸癌組織中miR-218表達(dá)水平明顯低于正常組織，提示miR-218可能在大腸癌中起抑癌基因的作用，提高miR-218的表達(dá)水平可能是一種潛在的治療大腸癌的方法，從miR-218表達(dá)水平與大腸癌臨床病理特征之間的關(guān)系可以看出，miR-218表達(dá)水平在不同性別、年齡、腫瘤大體形態(tài)、組織學(xué)類型、臨床分期、浸潤(rùn)深度、腫瘤分化程度中差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)，有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的較無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者表達(dá)低。miR-218在大腸癌中表達(dá)水平越低可能提示淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移越早，miR-218可能作為抑癌基因參與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展，且有望作為大腸癌診斷與預(yù)后判斷的分子標(biāo)志物。

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Expression and Clinical Significance of miR-218 in Colorectal CancerXUWen-jian1,LIUMing2a,SUXiu-lan2b.(1.DepartmentofGeneralSurgery,theAffiliatedPeople′sHospitalofInnerMongoliaMedicalUniversity,Hohhot010020,China; 2a.DepartmentofSurgicalOncology, 2b.ClinicalResearchCenter,theAffiliatedHospitalofInnerMongoliaMedicalUniversity,Hohhot010050,China)

Abstract：ObjectiveTo study the expression levels of miR-218 in colorectal cancer and normal tissues.MethodsUsing real-time quantitative polymerase chain reaction to detect the expression levels of miR-218 in 60 cases of colorectal cancer and the corresponding normal tissues,and calculate its relative expression.ResultsThe relative expression of miR-218 in the tissues of 60 patients with colorectal cancer was 0.33±0.12, it was significantly lower than the control group, the difference was statistically significant (P<0.05);there was no statistically significant difference in the expression of miR-218 in the general form of gender,age,tumor histological type,clinical stage,depth of invasion,and the degree of tumor differentiation(P>0.05); there was lower expression in lymph node metastasis than in those without lymph node metastasis(P<0.05).ConclusionmiR-218 shows low expression in colorectal cancer. Its lower expression levels may indicate earlier lymph node metastasis. miR-218 may act as a tumor suppressor gene involved in tumor development.

Key words:Colorectal cancer； miRNA-218； Real time-polymerase chain reaction

收稿日期：2014-10-27修回日期：2015-01-25編輯:薛惠文

基金項(xiàng)目：國(guó)家自然科學(xué)基金(81160254)；內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院重大項(xiàng)目(NYFYZD2010008)

doi：10.3969/j.issn.1006-2084.2015.09.052

中圖分類號(hào):R735.35

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

文章編號(hào)：1006-2084(2015)09-1674-03