呂麗賢，張陳彥，安雪麗，張銘娜，張立新

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磷酸肌酸對大鼠子宮缺血再灌注損傷的影響

呂麗賢，張陳彥，安雪麗，張銘娜，張立新

[作者單位]050011 石家莊，石家莊市第一醫(yī)院產科

[摘要]目的探討外源性磷酸肌酸預處理對大鼠子宮缺血再灌注損傷的保護作用及其機制。方法選擇SD雌性大鼠45只，隨機分為假手術組、缺血再灌注組和干預組，每組15只。干預組于缺血前30 min經腹腔注射磷酸肌酸注射液10 mg/kg，測定子宮組織中超氧化物歧化酶(SOD)活性和丙二醛(MDA)水平，并觀察子宮病理組織學改變。結果與假手術組比較，缺血再灌注組和干預組大鼠子宮組織SOD活性明顯降低，MDA含量明顯增加(P<0.05)；與缺血再灌注組比較，干預組SOD活性升高，MDA含量降低(P<0.05)。干預組病理組織學觀察炎性反應較缺血再灌注組明顯減輕。結論磷酸肌酸對大鼠子宮缺血再灌注損傷有保護作用，其機制可能與其增強SOD活性有關。

[關鍵詞]磷酸肌酸；再灌注損傷；子宮；大鼠, Sprague-Dawley

子宮缺血再灌注損傷是造成大出血和子宮壞死等并發(fā)癥的原因之一，如何減輕或防治子宮缺血再灌注損傷是目前研究熱點。本實驗通過建立大鼠子宮缺血再灌注模型，經磷酸肌酸預處理,觀察子宮缺血再灌注損傷后超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)變化及子宮病理組織學改變，探討磷酸肌酸對大鼠子宮缺血再灌注損傷的保護作用及可能機制，為臨床防治子宮缺血再灌注損傷提供依據。

1材料與方法

1.1實驗動物及分組成年SD雌性大鼠45只(由河北醫(yī)科大學動物實驗中心提供,合格證號：1409115)，體重(250±20)g，隨機分為假手術組、缺血再灌注組和干預組，每組15只。

1.2試劑SOD免疫試劑盒(南京建成試劑有限公司提供)，MDA測定試劑盒(上海谷研試劑有限公司提供)，磷酸肌酸注射液(海口奇力制藥股份有限公司提供)。

1.3動物模型制備缺血再灌注組和干預組禁食12 h，自由飲水，10%水合氯醛(350 mg/kg)腹腔注射麻醉。腹部正中切口進入腹腔，暴露子宮，在髂總動脈分叉處上方0.5 cm處用無創(chuàng)動脈夾夾閉腹腔動脈30 min，然后松開動脈夾再灌注60 min，造成子宮缺血再灌注模型[1]。假手術組以相同方法切開顯露子宮及血管，但不夾閉動脈。缺血前30 min，干預組經腹腔注射磷酸肌酸10 mg/kg，假手術組和缺血再灌注組于相同時間給予同等體積生理鹽水。

1.4SOD活性和MDA檢測切取子宮組織2.0 cm×0.2 cm，碾磨制成組織勻漿，3000 r/min，離心,10 min，取上清液；SOD活性檢測按照試劑盒說明書操作。MDA試劑盒測定大鼠子宮MDA水平：取大鼠子宮組織，濾紙拭干，稱質量后，加入4℃ HEPES緩沖液中，其體積是子宮組織塊質量的9倍，用玻璃勻漿器制成勻漿，以3000 r/min離心15 min，分裝于-70℃冰箱中保存?zhèn)溆?。按試劑盒說明書利用分光光度計檢測子宮組織MDA水平。

1.5子宮病理組織學觀察各組大鼠缺血或再灌注相應時間后取大鼠子宮。將所取大鼠子宮組織部分置于40 g/L多聚甲醛中4℃后固定，常規(guī)脫水，石蠟包埋后切片，蘇木精-伊紅染色顯微鏡下觀察。將剩余的大鼠子宮組織置于冷生理鹽水中漂洗干凈，用于MDA的測定。

2結果

2.1SOD活性及MDA的變化與假手術組比較，缺血再灌注組和干預組大鼠子宮組織SOD活性明顯降低，MDA含量明顯增加(P<0.05)；與缺血再灌注組比較，干預組SOD活性升高，MDA含量降低(P<0.05)。見表1。

表13組大鼠子宮組織中SOD活性

組別鼠數SOD(U/g)MDA(nmol/g)缺血再灌注組1523.63±3.16a59.54±8.71a干預組 1534.16±5.48ac41.08±5.96ac假手術組 1538.86±7.0135.81±7.41

注：SOD為超氧化物歧化酶，MDA為丙二醛；干預組經腹腔注射磷酸肌酸;與假手術組比較，aP<0.05;與缺血再灌注組比較，cP<0.05

2.2子宮組織形態(tài)學改變缺血再灌注組子宮組織細胞及間質明顯水腫，滲出增加，肌纖維排列紊亂，部分溶解，可見較多炎細胞浸潤；干預組子宮組織細胞及間質腫脹，肌纖維排列尚整齊，部分細胞及間質可見炎細胞浸潤減少，明顯輕于缺血再灌注組；假手術組子宮組織細胞及間質、肌纖維結構清晰，偶見炎細胞浸潤。見圖1～3。

3討論

磷酸肌酸是參與細胞能量代謝重要的物質之一，是存在于細胞內的一種高能磷酸化合物[2-4]，其通過促進磷酸核糖焦磷酸合成酶的作用，使細胞核苷酸得以保存，以合成二磷腺苷(ADP)，為三磷腺苷(ATP)補充能量，而ATP是任何細胞代謝過程中最重要的能量來源。補充磷酸肌酸能夠通過增加細胞中磷酸肌酸水平和ATP再合成的速率提高肌酸激酶/磷酸肌酸系統(tǒng)的功能[5]。在多數病理狀態(tài)下，磷酸肌酸對靶細胞的能量損傷具有明顯的療效[6]。缺血缺氧引起細胞內磷酸肌酸耗竭，ATP生成減少，導致細胞膜上Na+-K+-ATP酶失活，Na+內流，細胞因鈉水潴留出現腫脹[7]。外源性磷酸肌酸能夠直接通過進入細胞膜內，顯著增加磷酸肌酸的總體水平，使肌漿網上的鈣ATP酶活性恢復，鈣離子進入肌質網，避免細胞內鈣超負荷激活黃嘌呤去氫酶轉化為黃氧化酶，使氧自由基的產生減少[8]。

圖1　缺血再灌注組子宮組織形態(tài)學顯微鏡觀察所見

A.HE×100；B.HE×400

圖2　干預組子宮組織形態(tài)學顯微鏡觀察所見

A.HE×100；B.HE×400

圖3　假手術組子宮組織形態(tài)學顯微鏡觀察所見

A.HE×100；B.HE×400

目前，磷酸肌酸廣泛應用于心臟和腎缺血再灌注的疾病。磷酸肌酸可能是通過抑制炎性反應和激活磷脂酰肌醇3-激酶(PI-3K)/AKT/Bcl-2的信號傳導途徑對大鼠心肌缺血再灌注損傷起保護作用[9]。本實驗對大鼠子宮缺血30 min前給予磷酸肌酸預處理，再灌注60 min，研究其對子宮缺血再灌注有無保護作用及其可能機制，為臨床防治子宮缺血再灌注損傷提供實驗依據。

目前在大多數器官系統(tǒng)中缺血再灌注是一個公認的灌注不良的后果[10-11]。缺血/缺氧導致細胞消耗存儲的ATP和磷酸肌酸,恢復再灌注過程中，這些高能量磷酸鹽是維持細胞穩(wěn)態(tài)功能必不可少的。一般情況下，缺血再灌注損傷機制由自由基大量釋放、白細胞的活化、內皮系統(tǒng)功能障礙和補體途徑的激活等介導[12]。缺血/再灌注時組織及血漿中脂質過氧化物顯著增高，脂質過氧化增強造成細胞結構損傷和功能代謝障礙，導致細胞膜氧化破壞引起細胞凋亡和壞死[13]。因此，脂質過氧化反應已證實與缺血再灌注損傷引起的組織損傷密切相關，并且脂質過氧化反應代謝產物——MDA是用來評估脂質率過氧化反應的良好指標[14]。內源性抗氧化酶，如SOD通過消除氧自由基阻礙活性氧的產生，抑制脂質過氧化作用，保護細胞免受活性氧的不利影響。SOD活性增加被認為是缺血再灌注過程自由基產生的標志[15]，該抗氧化酶水平已被用來衡量在缺血再灌注損傷所發(fā)生的氧化應激的程度[16]。研究發(fā)現缺血再灌注損傷可廣泛發(fā)生于人體各臟器，對于器官移植手術，如肝移植、腎移植等，缺血再灌注損傷的輕重，直接影響著移植器官的存活，但是對于子宮組織的缺血再灌注損傷相關研究較少[1]。

本研究結果顯示，干預組子宮組織病理學改變較缺血再灌注組減輕，提示磷酸肌酸在減輕子宮缺血再灌注損傷方面有明顯的保護作用；與假手術組比較，缺血再灌注組和干預組子宮組織MDA含量增高，SOD活性降低，但與缺血再灌注組比較，干預組子宮組織MDA含量降低，SOD活性升高，提示磷酸肌酸能使MDA生成減少，從而減輕缺血再灌注子宮組織的脂質過氧化損傷，提高子宮組織內SOD活性，增強其清除自由基的能力，維持了子宮肌細胞氧化和抗氧化平衡，從而保護子宮肌細胞。

綜上所述，磷酸肌酸對大鼠子宮缺血再灌注損傷有保護作用，具體機制尚不清楚，可能與其增強SOD活性有關，有待進一步研究證實。

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(收稿時間：2015-01-18修回時間：2015-02-28)

·論著·

Effect of Phosphocreatine on Uterine Ischemia-reperfusion Injury in Rats

LYU Li-xian, ZHANG Chen-yan, AN Xue-li, ZHANG Ming-na, ZHANG Li-xin (Department of Gynecology and Obstetrics, the First Hospital of Shijiazhuang, Shijiazhuang 050011, China)

[Abstract]ObjectiveTo study the protective effect and its mechanisms of exogenous creatine phosphate (PCr) preconditioning on uterine ischemia-reperfusion injury in rats. MethodsA total of 45 SD female rats were randomly divided into sham operation group (n=15), ischemia-reperfusion group (n=15) and intervention group (n=15). The intervention group was given 10 mg/kg PCr injection via intraperitoneal injection 30 min before ischemia. The activity of superoxide dismutase (SOD) and malondialdehyde (MDA) level in uterine tissues were detected, and the pathological changes of uterus were also observed. ResultsCompared with those in the sham operation group, the SOD activities were significantly reduced, while MDA levels were significantly increased in ischemia-reperfusion and intervention groups (P<0.05); compared with those in ischemia-reperfusion group, the SOD activity was significantly increased, and MDA level was significantly reduced in the intervention group (P<0.05). Histopathological observation showed that inflammatory reaction in the intervention group was significantly alleviated compared with that in the ischemia-reperfusion group. ConclusionPCr may protect uterine ischemia-reperfusion injury to a certain degree in rats, and the mechanisms may be related with its activation to SOD activity.

[Key words]Phosphocreatine； Reperfusion injury； Uterus； Rats, Sprague-Dawley

[DOI]10.3969/j.issn.2095-140X.2015.05.008

[文獻標志碼][中國圖書資料分類號]R965；R-332A

[文章編號]2095-140X(2015)05-0026-03

[基金項目]石家莊市科技指導計劃(141462453)