呂麗賢，張陳彥，安雪麗，張銘娜，張立新

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磷酸肌酸對大鼠子宮缺血再灌注損傷的影響

呂麗賢，張陳彥，安雪麗，張銘娜，張立新

[作者單位]050011 石家莊，石家莊市第一醫(yī)院產(chǎn)科

[摘要]目的探討外源性磷酸肌酸預(yù)處理對大鼠子宮缺血再灌注損傷的保護(hù)作用及其機(jī)制。方法選擇SD雌性大鼠45只，隨機(jī)分為假手術(shù)組、缺血再灌注組和干預(yù)組，每組15只。干預(yù)組于缺血前30 min經(jīng)腹腔注射磷酸肌酸注射液10 mg/kg，測定子宮組織中超氧化物歧化酶(SOD)活性和丙二醛(MDA)水平，并觀察子宮病理組織學(xué)改變。結(jié)果與假手術(shù)組比較，缺血再灌注組和干預(yù)組大鼠子宮組織SOD活性明顯降低，MDA含量明顯增加(P<0.05)；與缺血再灌注組比較，干預(yù)組SOD活性升高，MDA含量降低(P<0.05)。干預(yù)組病理組織學(xué)觀察炎性反應(yīng)較缺血再灌注組明顯減輕。結(jié)論磷酸肌酸對大鼠子宮缺血再灌注損傷有保護(hù)作用，其機(jī)制可能與其增強(qiáng)SOD活性有關(guān)。

[關(guān)鍵詞]磷酸肌酸；再灌注損傷；子宮；大鼠, Sprague-Dawley

子宮缺血再灌注損傷是造成大出血和子宮壞死等并發(fā)癥的原因之一，如何減輕或防治子宮缺血再灌注損傷是目前研究熱點(diǎn)。本實(shí)驗(yàn)通過建立大鼠子宮缺血再灌注模型，經(jīng)磷酸肌酸預(yù)處理,觀察子宮缺血再灌注損傷后超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)變化及子宮病理組織學(xué)改變，探討磷酸肌酸對大鼠子宮缺血再灌注損傷的保護(hù)作用及可能機(jī)制，為臨床防治子宮缺血再灌注損傷提供依據(jù)。

1材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組成年SD雌性大鼠45只(由河北醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供,合格證號：1409115)，體重(250±20)g，隨機(jī)分為假手術(shù)組、缺血再灌注組和干預(yù)組，每組15只。

1.2試劑SOD免疫試劑盒(南京建成試劑有限公司提供)，MDA測定試劑盒(上海谷研試劑有限公司提供)，磷酸肌酸注射液(?？谄媪χ扑幑煞萦邢薰咎峁?。

1.3動(dòng)物模型制備缺血再灌注組和干預(yù)組禁食12 h，自由飲水，10%水合氯醛(350 mg/kg)腹腔注射麻醉。腹部正中切口進(jìn)入腹腔，暴露子宮，在髂總動(dòng)脈分叉處上方0.5 cm處用無創(chuàng)動(dòng)脈夾夾閉腹腔動(dòng)脈30 min，然后松開動(dòng)脈夾再灌注60 min，造成子宮缺血再灌注模型[1]。假手術(shù)組以相同方法切開顯露子宮及血管，但不夾閉動(dòng)脈。缺血前30 min，干預(yù)組經(jīng)腹腔注射磷酸肌酸10 mg/kg，假手術(shù)組和缺血再灌注組于相同時(shí)間給予同等體積生理鹽水。

1.4SOD活性和MDA檢測切取子宮組織2.0 cm×0.2 cm，碾磨制成組織勻漿，3000 r/min，離心,10 min，取上清液；SOD活性檢測按照試劑盒說明書操作。MDA試劑盒測定大鼠子宮MDA水平：取大鼠子宮組織，濾紙拭干，稱質(zhì)量后，加入4℃ HEPES緩沖液中，其體積是子宮組織塊質(zhì)量的9倍，用玻璃勻漿器制成勻漿，以3000 r/min離心15 min，分裝于-70℃冰箱中保存?zhèn)溆?。按試劑盒說明書利用分光光度計(jì)檢測子宮組織MDA水平。

1.5子宮病理組織學(xué)觀察各組大鼠缺血或再灌注相應(yīng)時(shí)間后取大鼠子宮。將所取大鼠子宮組織部分置于40 g/L多聚甲醛中4℃后固定，常規(guī)脫水，石蠟包埋后切片，蘇木精-伊紅染色顯微鏡下觀察。將剩余的大鼠子宮組織置于冷生理鹽水中漂洗干凈，用于MDA的測定。

2結(jié)果

2.1SOD活性及MDA的變化與假手術(shù)組比較，缺血再灌注組和干預(yù)組大鼠子宮組織SOD活性明顯降低，MDA含量明顯增加(P<0.05)；與缺血再灌注組比較，干預(yù)組SOD活性升高，MDA含量降低(P<0.05)。見表1。

表13組大鼠子宮組織中SOD活性

組別鼠數(shù)SOD(U/g)MDA(nmol/g)缺血再灌注組1523.63±3.16a59.54±8.71a干預(yù)組 1534.16±5.48ac41.08±5.96ac假手術(shù)組 1538.86±7.0135.81±7.41

注：SOD為超氧化物歧化酶，MDA為丙二醛；干預(yù)組經(jīng)腹腔注射磷酸肌酸;與假手術(shù)組比較，aP<0.05;與缺血再灌注組比較，cP<0.05

2.2子宮組織形態(tài)學(xué)改變?nèi)毖俟嘧⒔M子宮組織細(xì)胞及間質(zhì)明顯水腫，滲出增加，肌纖維排列紊亂，部分溶解，可見較多炎細(xì)胞浸潤；干預(yù)組子宮組織細(xì)胞及間質(zhì)腫脹，肌纖維排列尚整齊，部分細(xì)胞及間質(zhì)可見炎細(xì)胞浸潤減少，明顯輕于缺血再灌注組；假手術(shù)組子宮組織細(xì)胞及間質(zhì)、肌纖維結(jié)構(gòu)清晰，偶見炎細(xì)胞浸潤。見圖1～3。

3討論

磷酸肌酸是參與細(xì)胞能量代謝重要的物質(zhì)之一，是存在于細(xì)胞內(nèi)的一種高能磷酸化合物[2-4]，其通過促進(jìn)磷酸核糖焦磷酸合成酶的作用，使細(xì)胞核苷酸得以保存，以合成二磷腺苷(ADP)，為三磷腺苷(ATP)補(bǔ)充能量，而ATP是任何細(xì)胞代謝過程中最重要的能量來源。補(bǔ)充磷酸肌酸能夠通過增加細(xì)胞中磷酸肌酸水平和ATP再合成的速率提高肌酸激酶/磷酸肌酸系統(tǒng)的功能[5]。在多數(shù)病理狀態(tài)下，磷酸肌酸對靶細(xì)胞的能量損傷具有明顯的療效[6]。缺血缺氧引起細(xì)胞內(nèi)磷酸肌酸耗竭，ATP生成減少，導(dǎo)致細(xì)胞膜上Na+-K+-ATP酶失活，Na+內(nèi)流，細(xì)胞因鈉水潴留出現(xiàn)腫脹[7]。外源性磷酸肌酸能夠直接通過進(jìn)入細(xì)胞膜內(nèi)，顯著增加磷酸肌酸的總體水平，使肌漿網(wǎng)上的鈣ATP酶活性恢復(fù)，鈣離子進(jìn)入肌質(zhì)網(wǎng)，避免細(xì)胞內(nèi)鈣超負(fù)荷激活黃嘌呤去氫酶轉(zhuǎn)化為黃氧化酶，使氧自由基的產(chǎn)生減少[8]。

圖1　缺血再灌注組子宮組織形態(tài)學(xué)顯微鏡觀察所見

A.HE×100；B.HE×400

圖2　干預(yù)組子宮組織形態(tài)學(xué)顯微鏡觀察所見

A.HE×100；B.HE×400

圖3　假手術(shù)組子宮組織形態(tài)學(xué)顯微鏡觀察所見

A.HE×100；B.HE×400

目前，磷酸肌酸廣泛應(yīng)用于心臟和腎缺血再灌注的疾病。磷酸肌酸可能是通過抑制炎性反應(yīng)和激活磷脂酰肌醇3-激酶(PI-3K)/AKT/Bcl-2的信號傳導(dǎo)途徑對大鼠心肌缺血再灌注損傷起保護(hù)作用[9]。本實(shí)驗(yàn)對大鼠子宮缺血30 min前給予磷酸肌酸預(yù)處理，再灌注60 min，研究其對子宮缺血再灌注有無保護(hù)作用及其可能機(jī)制，為臨床防治子宮缺血再灌注損傷提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

目前在大多數(shù)器官系統(tǒng)中缺血再灌注是一個(gè)公認(rèn)的灌注不良的后果[10-11]。缺血/缺氧導(dǎo)致細(xì)胞消耗存儲(chǔ)的ATP和磷酸肌酸,恢復(fù)再灌注過程中，這些高能量磷酸鹽是維持細(xì)胞穩(wěn)態(tài)功能必不可少的。一般情況下，缺血再灌注損傷機(jī)制由自由基大量釋放、白細(xì)胞的活化、內(nèi)皮系統(tǒng)功能障礙和補(bǔ)體途徑的激活等介導(dǎo)[12]。缺血/再灌注時(shí)組織及血漿中脂質(zhì)過氧化物顯著增高，脂質(zhì)過氧化增強(qiáng)造成細(xì)胞結(jié)構(gòu)損傷和功能代謝障礙，導(dǎo)致細(xì)胞膜氧化破壞引起細(xì)胞凋亡和壞死[13]。因此，脂質(zhì)過氧化反應(yīng)已證實(shí)與缺血再灌注損傷引起的組織損傷密切相關(guān)，并且脂質(zhì)過氧化反應(yīng)代謝產(chǎn)物——MDA是用來評估脂質(zhì)率過氧化反應(yīng)的良好指標(biāo)[14]。內(nèi)源性抗氧化酶，如SOD通過消除氧自由基阻礙活性氧的產(chǎn)生，抑制脂質(zhì)過氧化作用，保護(hù)細(xì)胞免受活性氧的不利影響。SOD活性增加被認(rèn)為是缺血再灌注過程自由基產(chǎn)生的標(biāo)志[15]，該抗氧化酶水平已被用來衡量在缺血再灌注損傷所發(fā)生的氧化應(yīng)激的程度[16]。研究發(fā)現(xiàn)缺血再灌注損傷可廣泛發(fā)生于人體各臟器，對于器官移植手術(shù)，如肝移植、腎移植等，缺血再灌注損傷的輕重，直接影響著移植器官的存活，但是對于子宮組織的缺血再灌注損傷相關(guān)研究較少[1]。

本研究結(jié)果顯示，干預(yù)組子宮組織病理學(xué)改變較缺血再灌注組減輕，提示磷酸肌酸在減輕子宮缺血再灌注損傷方面有明顯的保護(hù)作用；與假手術(shù)組比較，缺血再灌注組和干預(yù)組子宮組織MDA含量增高，SOD活性降低，但與缺血再灌注組比較，干預(yù)組子宮組織MDA含量降低，SOD活性升高，提示磷酸肌酸能使MDA生成減少，從而減輕缺血再灌注子宮組織的脂質(zhì)過氧化損傷，提高子宮組織內(nèi)SOD活性，增強(qiáng)其清除自由基的能力，維持了子宮肌細(xì)胞氧化和抗氧化平衡，從而保護(hù)子宮肌細(xì)胞。

綜上所述，磷酸肌酸對大鼠子宮缺血再灌注損傷有保護(hù)作用，具體機(jī)制尚不清楚，可能與其增強(qiáng)SOD活性有關(guān)，有待進(jìn)一步研究證實(shí)。

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(收稿時(shí)間：2015-01-18修回時(shí)間：2015-02-28)

·論著·

Effect of Phosphocreatine on Uterine Ischemia-reperfusion Injury in Rats

LYU Li-xian, ZHANG Chen-yan, AN Xue-li, ZHANG Ming-na, ZHANG Li-xin (Department of Gynecology and Obstetrics, the First Hospital of Shijiazhuang, Shijiazhuang 050011, China)

[Abstract]ObjectiveTo study the protective effect and its mechanisms of exogenous creatine phosphate (PCr) preconditioning on uterine ischemia-reperfusion injury in rats. MethodsA total of 45 SD female rats were randomly divided into sham operation group (n=15), ischemia-reperfusion group (n=15) and intervention group (n=15). The intervention group was given 10 mg/kg PCr injection via intraperitoneal injection 30 min before ischemia. The activity of superoxide dismutase (SOD) and malondialdehyde (MDA) level in uterine tissues were detected, and the pathological changes of uterus were also observed. ResultsCompared with those in the sham operation group, the SOD activities were significantly reduced, while MDA levels were significantly increased in ischemia-reperfusion and intervention groups (P<0.05); compared with those in ischemia-reperfusion group, the SOD activity was significantly increased, and MDA level was significantly reduced in the intervention group (P<0.05). Histopathological observation showed that inflammatory reaction in the intervention group was significantly alleviated compared with that in the ischemia-reperfusion group. ConclusionPCr may protect uterine ischemia-reperfusion injury to a certain degree in rats, and the mechanisms may be related with its activation to SOD activity.

[Key words]Phosphocreatine； Reperfusion injury； Uterus； Rats, Sprague-Dawley

[DOI]10.3969/j.issn.2095-140X.2015.05.008

[文獻(xiàn)標(biāo)志碼][中國圖書資料分類號]R965；R-332A

[文章編號]2095-140X(2015)05-0026-03

[基金項(xiàng)目]石家莊市科技指導(dǎo)計(jì)劃(141462453)