付朝泓綜述 李 艷審校

BCR-ABL融合基因檢測(cè)在CML診斷及治療中的應(yīng)用進(jìn)展

付朝泓綜述 李 艷*審校

BCR-ABL融合基因是慢性粒細(xì)胞白血病(CML)的特異性腫瘤標(biāo)志物，在CML的診斷和治療監(jiān)測(cè)中有重要作用。費(fèi)城陽(yáng)性(Ph+)染色體細(xì)胞或BCR-ABL融合基因數(shù)量的變化是評(píng)估CML的重要手段，臨床常用檢測(cè)方法有常規(guī)染色體分析、熒光原位雜交(FISH)和熒光定量PCR。常規(guī)染色體檢測(cè)用于CML初始治療獲得完全細(xì)胞學(xué)緩解(CCyR)的評(píng)價(jià)；FISH較常規(guī)染色體檢測(cè)更敏感且能可視化觀測(cè)Ph+染色體細(xì)胞；熒光定量PCR更加利于CML微小殘留病監(jiān)測(cè)。這些技術(shù)方法正在不斷滿足輔助診斷CML的臨床要求及進(jìn)一步提升CML療效監(jiān)測(cè)和微小殘留病診斷水平。

BCR/ABL融合基因；慢性粒細(xì)胞白血??；診斷；治療監(jiān)測(cè)

慢性粒細(xì)胞白血病(Chronic Myeloid Leukemia, CML)是一種惡性骨髓增殖性疾病，占所有成人白血病的15%-20%[1,2]，主要特征是成熟和未成熟粒細(xì)胞的克隆性表達(dá)[1]。90%-95%的CML患者都能檢測(cè)到費(fèi)城(Philadelphia, Ph)染色體和BCR-ABL融合基因[3]。在Ph染色體形成過(guò)程中，9號(hào)染色體長(zhǎng)臂3區(qū)4帶(9q34)前癌基因c-ABL的3'端與22號(hào)染色體長(zhǎng)臂1區(qū)1帶(22q11)斷裂點(diǎn)簇集區(qū)(Breakpoint Cluster Region，BCR)基因的5'端融合，在22號(hào)染色體上形成BCR-ABL融合基因，同時(shí)在9號(hào)染色體上形成無(wú)致病性的ABL-BCR融合基因[3]。BCR-ABL融合基因ABL激酶區(qū)的結(jié)構(gòu)改變[3]，可過(guò)度激活膜受體酪氨酸蛋白激酶(Ras-Raf-MAPK)信號(hào)通路、膜受體磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K-AKT-mTOR)信號(hào)通路以及膜受體JAK激酶與信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)及轉(zhuǎn)錄激活蛋白(JAK-STAT)信號(hào)通路，上調(diào)白血病細(xì)胞的增殖和存活數(shù)量(圖1)，成為CML患者骨髓增生難以控制的主要原因[1,3]。

圖1 BCR-ABL融合基因的形成及致病通路[4]

目前檢測(cè)BCR-ABL融合基因或Ph+染色體的方法包括逆轉(zhuǎn)錄后直接測(cè)序法、Southen Blot、Western Blot、逆轉(zhuǎn)錄后普通PCR、常規(guī)染色體檢測(cè)、熒光原位雜交技術(shù)(FISH)以及以PCR技術(shù)為基礎(chǔ)的熒光定量PCR等。逆轉(zhuǎn)錄后直接測(cè)序法是檢測(cè)BCR-ABL融合基因最直接的方法，但是成本高、檢測(cè)時(shí)間長(zhǎng)，常規(guī)應(yīng)用于臨床受到一定限制。逆轉(zhuǎn)錄后普通PCR和Western Blot敏感性較低，Southern Blot需要使用放射性同位素，常應(yīng)用于動(dòng)物實(shí)驗(yàn)。常規(guī)染色體檢測(cè)是最基礎(chǔ)的臨床輔助診斷CML的方法，三代FISH是常規(guī)染色體檢測(cè)的進(jìn)步，尤其第三代FISH在Ph+染色體隱匿核型、變異核型、基因序列缺失的檢測(cè)中有一定優(yōu)勢(shì)，但是這兩種方法都不易檢測(cè)到CML患者治療后Ph+細(xì)胞殘留[5]，因此需要更敏感的熒光定量PCR進(jìn)行分析，以利于對(duì)CML患者治療后微小殘留病的分子監(jiān)測(cè)。本文對(duì)上述常規(guī)染色體、FISH和熒光定量PCR檢測(cè)在CML診斷和治療監(jiān)測(cè)中的應(yīng)用進(jìn)展綜述如下。

1 常規(guī)染色體檢測(cè)在CML診斷及治療監(jiān)測(cè)中的應(yīng)用

1.1 對(duì)CML的診斷作用

常規(guī)染色體檢測(cè)是通過(guò)染色體顯帶技術(shù)對(duì)分裂中期細(xì)胞染色體進(jìn)行觀察并與正常染色體進(jìn)行比對(duì)后對(duì)疾病進(jìn)行診斷的一種方法。由于CML患者生存期從幾個(gè)月到十幾年，染色體會(huì)出現(xiàn)假二倍體、數(shù)量改變等異常核型。Muvarak等[6]認(rèn)為BCR-ABL融合基因陽(yáng)性CML患者有多種類型的基因不穩(wěn)定性，如DNA缺失、嵌入等，導(dǎo)致Ph染色體以外的染色體改變，且這種不穩(wěn)定性基因在異常造血干細(xì)胞內(nèi)的克隆先于Ph染色體發(fā)生，同時(shí)認(rèn)為 BCR/ABL 基因還能促進(jìn)這種遺傳不穩(wěn)定性。因此，常規(guī)染色體核型分析對(duì)CML患者診斷和分型等有重要作用。

1.2 對(duì)CML的治療監(jiān)測(cè)作用

常規(guī)染色體方法從細(xì)胞層面，將CML治療情況進(jìn)行評(píng)價(jià)，依據(jù)Ph+分裂中期細(xì)胞所占比例將其分為少量細(xì)胞學(xué)緩解(35%-90%)、部分細(xì)胞學(xué)緩解(1%-34%)和完全細(xì)胞學(xué)緩解(Complete Cytogenetic Response, CCyR)(0%)，方法是在培養(yǎng)的CML骨髓細(xì)胞中觀測(cè)至少20個(gè)分裂中期細(xì)胞來(lái)計(jì)數(shù)最低Ph+細(xì)胞的數(shù)量，至少應(yīng)檢測(cè)到一個(gè)Ph+細(xì)胞，即檢測(cè)下限為5%(1/20)[7]。CCyR是酪氨酸激酶抑制劑(Tyrosine Kinase Inhibitor, TKI)治療中的首要目標(biāo)和具有顯著預(yù)后價(jià)值的指標(biāo)，臨床研究證實(shí)，CML患者通過(guò)TKI治療6個(gè)月后出現(xiàn)CCyR可判斷治療有效[8]；NCCN(National Comprehensive Cancer Network)指南[7]提出，TKI首次治療3個(gè)月，常規(guī)染色體檢測(cè)達(dá)到CCyR，也可視為治療有效。有數(shù)據(jù)表明，CML患者在急性加重期或急變危相期治療12個(gè)月后達(dá)到CCyR，提示患者預(yù)后較好[8]。

2 FISH在CML診斷及治療監(jiān)測(cè)中的應(yīng)用

2.1 對(duì)CML的診斷作用

FISH是應(yīng)用分子探針對(duì)至少200個(gè)分裂核細(xì)胞進(jìn)行最低BCR-ABL融合基因陽(yáng)性細(xì)胞檢測(cè)，至少應(yīng)檢測(cè)到一個(gè)陽(yáng)性細(xì)胞，即檢測(cè)下限為0.5%(1/200)，該方法對(duì)CML微小殘留病診斷有臨床應(yīng)用價(jià)值[9]。FISH技術(shù)根據(jù)探針設(shè)計(jì)的發(fā)展進(jìn)程分為第一代FISH、第二代FISH和第三代FISH。第一代FISH應(yīng)用雙色信號(hào)融合探針技術(shù)來(lái)分析分裂中期和間期細(xì)胞的BCR-ABL融合基因，用紅色熒光標(biāo)記ABL探針，用綠色熒光標(biāo)記BCR探針，雜交染色后，在正常染色體，探針會(huì)與22號(hào)染色體ABL基因和9號(hào)染色體BCR基因結(jié)合，分別產(chǎn)生一個(gè)紅色和一個(gè)綠色信號(hào)；而在Ph+染色體，探針會(huì)使22號(hào)Ph+染色體ABL-BCR融合基因同時(shí)產(chǎn)生紅、綠雙色信號(hào)(雙色濾過(guò)后成為黃色)。FISH的優(yōu)勢(shì)在于實(shí)現(xiàn)單個(gè)細(xì)胞BCR-ABL融合基因的可視化，因此對(duì)CML的診斷比常規(guī)染色體檢測(cè)敏感性更高[10]。但由于平面視角的可重疊性，第一代FISH可出現(xiàn)假陽(yáng)性及假陰性結(jié)果，從而限制了其對(duì)CML微小殘留病的診斷作用[11]。第二代FISH可避免這些假性結(jié)果，從而在CML殘留病中得到了應(yīng)用。第三代FISH與第二代FISH的不同在于可根據(jù)對(duì)CML診斷目的不同而設(shè)計(jì)探針位置和熒光顏色，對(duì)Ph+染色體隱匿核型、變異核型、基因序列缺失的診斷有明顯優(yōu)勢(shì)。不過(guò)，F(xiàn)ISH無(wú)法發(fā)現(xiàn)CML進(jìn)展期發(fā)生了改變的非Ph+染色體，必須結(jié)合常規(guī)染色體檢測(cè)對(duì)早期CML進(jìn)行診斷。

2.2 對(duì)CML的治療監(jiān)測(cè)作用

第二代FISH的探針設(shè)計(jì)是利用650kb ABL大型探針聯(lián)合300kb BCR探針形成BCR-ABL雙色額外信號(hào)探針(ES)，Ph+染色體細(xì)胞上有2個(gè)黃色融合信號(hào)：一個(gè)在22號(hào)Ph染色體BCR-ABL融合基因上，另一個(gè)在9號(hào)染色體ABL-BCR融合基因上，可避免正常細(xì)胞假陽(yáng)性和Ph+細(xì)胞假陰性結(jié)果，從而精確地從正常細(xì)胞中區(qū)分出Ph+細(xì)胞。第二代FISH對(duì)CML治療監(jiān)測(cè)價(jià)值在于對(duì)Ph+細(xì)胞總量的定量檢測(cè)及BCR-ABL融合基因精確檢測(cè)更準(zhǔn)確，對(duì)TKI耐藥監(jiān)測(cè)中也得到很好的應(yīng)用[12]。第二代FISH還能鑒定隱匿性5’-ABL缺失的Ph+慢性髓細(xì)胞白血病。

第三代FISH根據(jù)探針設(shè)計(jì)形成了三倍探針技術(shù)，應(yīng)用不同顏色探針來(lái)分別標(biāo)記5’-精氨酸合酶(ASS)和ABL，再聯(lián)合300kb BCR探針來(lái)檢測(cè)ABL及BCR-ABL融合基因中的重要缺失；或利用單獨(dú)顏色探針聯(lián)合300kb BCR探針跨越雙位點(diǎn)來(lái)檢測(cè)Ph+細(xì)胞，也可以用來(lái)監(jiān)測(cè)CML治療[13]。隨著更多顏色熒光染料的應(yīng)用，一種多色FISH技術(shù)在白血病及相關(guān)腫瘤的診斷和治療中得到應(yīng)用。多色FISH應(yīng)用5種熒光染料，通過(guò)組合標(biāo)記，使用全染色體涂染探針，結(jié)合特殊的濾色片及數(shù)字化成像技術(shù)，經(jīng)過(guò)熒光顯微鏡及專業(yè)化計(jì)算機(jī)分析系統(tǒng)，能準(zhǔn)確分離和確認(rèn)所有熒光標(biāo)記的染色體，在白血病復(fù)雜核型研究方面得到了很好的應(yīng)用，如對(duì)白血病細(xì)胞遺傳學(xué)演化特點(diǎn)、相互易位機(jī)制以及對(duì)微小殘留病細(xì)胞系的特點(diǎn)研究等[14]。

3 熒光定量PCR在ABL突變和CML微小殘留病療效監(jiān)測(cè)中的應(yīng)用

3.1 ABL耐藥突變分析

在CML患者應(yīng)用TKI治療期間，應(yīng)用BCR-ABL 熒光定量PCR進(jìn)行分子監(jiān)測(cè)，既能評(píng)價(jià)療效，又能發(fā)現(xiàn)TKI耐藥突變。體外耐藥試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)伊馬替尼(Imatinib)高頻率耐藥突變位點(diǎn)包括Y253H、E255K、T315I和F359C/V，低頻率突變位點(diǎn)包括M244V、L248V、G250E[15]，隨著TKI應(yīng)用越來(lái)越廣泛，除了泛耐藥T315I突變外，其它ABL激酶區(qū)耐藥突變由二代TKI如尼洛替尼(Nilotinib)、坦桑替尼(Dasatinib)或布蘇替尼(Blsutinib)治療所引起[16]。T315I泛耐藥突變CML患者采用三代TKI泊松替尼(Ponatinib)療效較好[17-19]。

ABL激酶區(qū)TKI耐藥突變表現(xiàn)為BCR-ABL RNA水平升高，細(xì)胞異?？寺20]。Baccarani等[21]針對(duì)治療失敗病例、TKI效果欠佳病例、BCR-ABL RNA水平上升病例進(jìn)行了耐藥分析，結(jié)果表明CML患者的臨床結(jié)局與ABL激酶區(qū)突變相關(guān)。在對(duì)治療失敗病例的分析中發(fā)現(xiàn)，ABL激酶區(qū)突變與疾病晚期、老年及治療12個(gè)月未獲得CCyR高度相關(guān)[21,22]。通過(guò)BCR-ABL熒光定量PCR監(jiān)測(cè)發(fā)現(xiàn)，TKI耐藥突變常常是后天獲得性耐藥突變，而非原發(fā)性耐藥突變[23]。但BCR-ABL 熒光定量PCR監(jiān)測(cè)方法存在如下問(wèn)題：一是BCR-ABL 熒光定量PCR敏感性較高，所監(jiān)測(cè)的BCR-ABL RNA高水平表達(dá)不一定都能真實(shí)反映耐藥克??；另一方面，BCR-ABL 熒光定量PCR監(jiān)測(cè)在CML白血病細(xì)胞總數(shù)較低時(shí)檢測(cè)到的突變不能確定是暫時(shí)的或是非病理性的，因而無(wú)法確定患者是否需要改變治療方案[21,22]。所以，針對(duì)該方法檢測(cè)出來(lái)的突變結(jié)果應(yīng)由臨床專家來(lái)解讀。

對(duì)于BCR-ABL熒光定量PCR監(jiān)測(cè)發(fā)現(xiàn)的BCR-ABL RNA水平升高是否需要進(jìn)行測(cè)序分析，應(yīng)根據(jù)臨床治療情況而定。NCCN推薦對(duì)BCR-ABL RNA水平升高5-10倍的病例進(jìn)行測(cè)序分析，特別是沒(méi)有獲得首要分子效應(yīng)(Major Molecular Response,MMR)的CML患者[7]。但需特別指出的是，BCR-ABL RNA水平升高10倍者的測(cè)序分析可能缺乏敏感性，例如轉(zhuǎn)錄水平從0.0001%升高到0.001%，雖然升高了10倍，但測(cè)序分析也檢測(cè)不到突變結(jié)果。另外，熒光定量PCR監(jiān)測(cè)中，較低量級(jí)的BCR-ABL RNA水平上升可能丟失很多突變結(jié)果。Radich等[24]的研究表明，在低MMR水平中應(yīng)用BCR-ABL 熒光定量PCR檢測(cè)時(shí)，因?yàn)锽CR-ABL RNA只有很小幅度的升高，如從0.01%增加到0.02%，雖然只增加了一倍，而未能進(jìn)行ABL激酶區(qū)的測(cè)序分析；當(dāng)然也可以懷疑這種升高可能是實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)不精確引起的，如在1-3個(gè)月內(nèi)重復(fù)檢測(cè)就會(huì)出現(xiàn)這種現(xiàn)象[25]。故而會(huì)漏掉一些耐藥突變病例。

3.2 CML微小殘留病的治療監(jiān)測(cè)

白血病微小殘留病是指在白血病經(jīng)治療獲得CCyR后或骨髓移植治療后，體內(nèi)仍殘留有少量白血病細(xì)胞的狀態(tài)。此時(shí)，常規(guī)染色體檢測(cè)已難以檢出白血病細(xì)胞，但實(shí)際上患者骨髓內(nèi)的白血病細(xì)胞還存在，這些殘存的細(xì)胞即成為白血病復(fù)發(fā)的根源。

CML患者經(jīng)TKI治療后三個(gè)月是否達(dá)到CCyR，其體內(nèi)殘留的白血病細(xì)胞可用FISH進(jìn)行檢測(cè)，但NCCN沒(méi)有將FISH作為TKI治療的敏感性監(jiān)測(cè)方法，特別是中期Ph+細(xì)胞在5%-10%之間的患者[7]。熒光定量PCR為NCCN所推薦，對(duì)CML微小殘留病有很高的評(píng)估價(jià)值。有研究表明，用熒光定量PCR檢測(cè)殘留白血病細(xì)胞總量水平能準(zhǔn)確定義CCyR水平[26]。BCR-ABL 熒光定量PCR敏感性達(dá)到了0.001%-0.0001%，相當(dāng)于在100 000-1 000 000個(gè)正常細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)一個(gè)表達(dá)BCR-ABL RNA的細(xì)胞，因而能直接定量BCR-ABL RNA水平[24,26]。

熒光定量PCR檢測(cè)樣本包括外周血和骨髓，外周血抽取便利，監(jiān)測(cè)結(jié)果和臨床治療效果具有一致性[24]。NCCN指南推薦CML患者達(dá)到CCyR后應(yīng)該每三個(gè)月進(jìn)行一次BCR-ABL 熒光定量PCR檢測(cè)，用來(lái)監(jiān)測(cè)殘留白血病細(xì)胞有否上升、下降或處于穩(wěn)定狀態(tài)[26]。Marin等[27]對(duì)達(dá)到CCyR后患者每三個(gè)月應(yīng)用熒光定量PCR檢測(cè)一次BCR-ABL RNA水平，發(fā)現(xiàn)BCR-ABL RNA水平和TKI長(zhǎng)期治療相關(guān)，即TKI治療時(shí)間越長(zhǎng)，BCR-ABL RNA水平越低。因此在已經(jīng)獲得CCyR的患者中應(yīng)用BCR-ABL 熒光定量PCR進(jìn)行早期復(fù)發(fā)監(jiān)測(cè)有很重要的積極意義。國(guó)際干擾素隨機(jī)研究實(shí)驗(yàn)(IRIS)[27]對(duì)CML患者外周血進(jìn)行的監(jiān)測(cè)顯示，BCR-ABL 熒光定量PCR可預(yù)測(cè)CCyR的穩(wěn)定性。該實(shí)驗(yàn)對(duì)象為應(yīng)用Imatinib治療達(dá)到CCyR后的CML患者，其BCR-ALB RNA水平較治療前下降大于1 000倍且有較長(zhǎng)的無(wú)進(jìn)展生存期(Progression-free Survival,PFS)，因此將CML患者經(jīng)治療達(dá)到CCyR后，BCR-ABL RNA水平降低1 000倍以上定義為達(dá)到CCyR的MMR，并作為治療的目標(biāo)。還有研究指出，若CML患者的BCR-ABL RNA水平為陰性(不能檢測(cè)到BCR-ABL RNA表達(dá))即為完全分子效應(yīng)(Complete Molecular Response, CMR)，獲得CMR的患者比只獲得MMR的患者具有更長(zhǎng)的PFS[26,28]，可作為CML治療的新目標(biāo)。

3.3 熒光定量PCR國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)

盡管BCR-ABL RNA檢測(cè)在TKI治療中具有很高的價(jià)值，但由于各個(gè)獨(dú)立實(shí)驗(yàn)室所用PCR技術(shù)各有不同，實(shí)驗(yàn)結(jié)果無(wú)法進(jìn)行比較，因此對(duì)臨床治療監(jiān)測(cè)和不同研究數(shù)據(jù)的分析和結(jié)論造成一定的困擾。BCR-ABL RNA水平國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)(IS)的建立解決了這個(gè)問(wèn)題。由三個(gè)IRIS檢測(cè)的30個(gè)預(yù)處理樣本BCR-ABL RNA水平被專家確認(rèn)為100% IS[28]。同時(shí)還為不同實(shí)驗(yàn)室設(shè)定了轉(zhuǎn)換因子(Conversion Factor, CF)，以校正不同條件的實(shí)驗(yàn)操作，如不同的參考基因、PCR引物、提取方法及熒光定量PCR中逆轉(zhuǎn)錄應(yīng)用等所造成的檢測(cè)結(jié)果差異。IS和CF的作用已經(jīng)在不同實(shí)驗(yàn)室MMR檢測(cè)中得到了很好的應(yīng)用[29]。

BCR-ABL 熒光定量PCR的標(biāo)準(zhǔn)參考材料已由CML專業(yè)實(shí)驗(yàn)室通過(guò)WHO國(guó)際基因參考組織合成[30]。該參考材料為凍干混合物，由白血病細(xì)胞系K562和HL60組成，參考基因是BCR、ABL或β-葡萄糖醛酸苷酶基因(GUSB)，經(jīng)過(guò)IS實(shí)驗(yàn)室測(cè)試，這種材料在37℃以下至少穩(wěn)定10個(gè)月。這種標(biāo)準(zhǔn)化參考材料需要組織培養(yǎng)，資源寶貴，其最佳利用方式是應(yīng)用其調(diào)整和驗(yàn)證二級(jí)參考試劑。根據(jù)BCR-ABL熒光定量PCR國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)，一些專業(yè)實(shí)驗(yàn)室已經(jīng)研發(fā)了二級(jí)參考試劑，商業(yè)試劑公司也在商品試劑盒中應(yīng)用了二級(jí)參考試劑，大多數(shù)常規(guī)實(shí)驗(yàn)室可以應(yīng)用BCR-ABL RNA二級(jí)參考試劑進(jìn)行檢測(cè)，并能快速形成國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)化報(bào)告。

4 結(jié)語(yǔ)

綜上所述，BCR-ABL融合基因的應(yīng)用檢測(cè)對(duì)CML診斷和治療監(jiān)測(cè)有重要臨床作用，針對(duì)CML不同階段選擇不同方法進(jìn)行輔助診斷和治療監(jiān)測(cè)，豐富了個(gè)體化醫(yī)療內(nèi)容，尤其是BCR-ABL熒光定量PCR，可作為治療監(jiān)測(cè)的標(biāo)準(zhǔn)。CML進(jìn)展期患者、Imatinib治療無(wú)效患者、imatinib治療有效但BCR-ABL RNA水平升高患者進(jìn)行ABL激酶區(qū)TKI耐藥突變的分子監(jiān)測(cè)，對(duì)阻止疾病進(jìn)展和評(píng)估預(yù)后有積極臨床意義。

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本文作者簡(jiǎn)介：

付朝泓(1978-)，男，漢族，碩士，主管技師，研究方向：臨床分子診斷

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糖基化載脂蛋白A-I水平與2型糖尿病患者的冠狀動(dòng)脈斑塊進(jìn)展相關(guān)

本刊編委，上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬瑞金醫(yī)院心內(nèi)科蒲里津教授等在《Diabetes Care》(2013，36(5)：1 312-1 320，1區(qū)，IF=7.78)發(fā)表了題為“Glycation of apoprotein A-I is associated with coronary artery plaque progression in type 2 diabetic patients”的研究論文，主要內(nèi)容如下：

1 研究背景和目的：高密度脂蛋白(HDL)通過(guò)促進(jìn)巨噬細(xì)胞內(nèi)的膽固醇流出和運(yùn)輸，即膽固醇的逆向轉(zhuǎn)運(yùn)(RCT)發(fā)揮抗動(dòng)脈粥樣硬化功能。這種RCT效率取決于卵磷脂膽固醇酰基轉(zhuǎn)移酶(LCAT)的激活，使細(xì)胞和脂蛋白源性的膽固醇酯化，形成濃度梯度，將游離膽固醇轉(zhuǎn)運(yùn)到HDL。其中載脂蛋白A-Ⅰ(apoA-I) 激活LCAT是RCT的關(guān)鍵步驟。載脂蛋白的糖氧化修飾可改變其結(jié)構(gòu)、構(gòu)象和功能，從而損害其激活LCAT的能力，因此可能與HDL功能不全及2型糖尿病(T2DM)患者并發(fā)冠心病(CAD)有關(guān)。本研究探討糖基化apoA-I水平是否與T2DM患者的CAD及斑塊進(jìn)展有關(guān)。

2 方法： 連續(xù)入選272例T2DM患者，其中無(wú)明顯冠狀動(dòng)脈病變(管腔直徑狹窄<30%)者82例(I組)，顯著CAD患者(管腔直徑狹窄≥70%)190例(II組)，同時(shí)選擇136例健康受試者為對(duì)照組。超速離心全血獲得HDL,采用SDS-PAGE電泳分離apoA-I,免疫印跡分析apoA-I糖基化水平(以條帶的相對(duì)密度表示) 。通過(guò)直接測(cè)量血清內(nèi)源性未酯化膽固醇減少量分析LCAT活性，分析比較各組糖基化apoA-I水平及LCAT活性差異。在1年隨訪中，對(duì)II組患者進(jìn)行了定量冠脈造影(QCA，n=159)和血管內(nèi)超聲顯像(IVUS，n=127)檢查，分析冠狀動(dòng)脈評(píng)分、冠狀動(dòng)脈狹窄累積評(píng)分和斑塊容積百分比變化以評(píng)估冠狀動(dòng)脈斑塊進(jìn)展情況。

3 結(jié)果：apoA-I糖基化水平從對(duì)照組(1.35±0.41)、I組(5.50±1.40)到II組(10.12±4.76)明顯增加(P<0.01)，LCAT活性從對(duì)照組(0.30±0.04μmol/ml·h)、I組(0.25±0.04μmol/ml·h)到II組(0.20±0.03μmol/ml·h)逐步下降(P<0.01)。在1年隨訪中，QCA發(fā)現(xiàn)159例患者中有45例發(fā)生斑塊進(jìn)展，IVUS發(fā)現(xiàn)127例患者中有38例發(fā)生斑塊進(jìn)展, QCA及IVUS斑塊進(jìn)展者的apoA-I糖基化水平(12.80±5.11)及(11.86±3.88)分別明顯高于無(wú)斑塊進(jìn)展者(8.91±4.10)及(7.69±3.04)(P均<0.01)，而LCAT活性(0.196±0.022μmol/ml·h)及(0.198±0.025μmol/ml·h)明顯低于無(wú)斑塊進(jìn)展者(0.224±0.030μmol/ml·h)及(0.221±0.028μmol/ml·h)(P均<0.01)。apoA-I糖基化水平與冠狀動(dòng)脈評(píng)分的變化、冠狀動(dòng)脈狹窄累積評(píng)分和斑塊容積百分比變化均呈正相關(guān)(r分別為0.529、0.661、0.618，P均<0.01)。Logistic回歸分析表明apoA-I糖基化水平是T2DM患者發(fā)生CAD (OR 2.39 ，95%CI 1.62-3.52,P<0.01)和斑塊進(jìn)展(OR 1.32，95%CI 1.17-1.48,P<0.01)風(fēng)險(xiǎn)的獨(dú)立預(yù)測(cè)因素。

4 結(jié)論： apoA-I糖基化水平與T2DM患者冠狀動(dòng)脈疾病及冠脈斑塊進(jìn)展相關(guān)。

武漢大學(xué)人民醫(yī)院，武漢 430060;*通迅作者：E-mail:yanlitf1120@163.com

本文2014-12-23收到，2015-03-10修回

R733.7

A

1005-1740(2015)02-0071-05