宋 輝 楊 芳

巨噬細(xì)胞泡沫化對(duì)炎癥反應(yīng)的影響*

宋 輝 楊 芳#

目的：觀察巨噬細(xì)胞泡沫化對(duì)促炎因子水平的影響。方法：取6-8周齡C57BL/6J雄性小鼠骨髓細(xì)胞，采用L929培養(yǎng)分化成巨噬細(xì)胞。在巨噬細(xì)胞懸液中加入不同濃度氧化型低密度脂蛋白(ox-LDL)，分為空白對(duì)照組(0μg/ml)、10μg/ml組和25 μg/ml組，再培養(yǎng)24h后觀察各組細(xì)胞泡沫化程度，檢測(cè)分析各組泡沫細(xì)胞中促炎因子白細(xì)胞介素-1β(IL-1β)和腫瘤壞死因子-α(TNF-α)mRNA的表達(dá)水平。結(jié)果：所取骨髓細(xì)胞被成功分化為巨噬細(xì)胞。不同濃度ox-LDL均能誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞的泡沫化，25μg/ml組巨噬細(xì)胞泡沫化程度高于10μg/ml組(P<0.01)。與空白對(duì)照組相比，25μg/ml組的IL-1β和TNF-α mRNA表達(dá)水平均顯著降低(P<0.05)。結(jié)論：巨噬細(xì)胞泡沫化可以抑制炎癥反應(yīng)。

巨噬細(xì)胞；泡沫化；促炎因子；小鼠

冠心病是世界上死亡率最高的疾病之一，其主要病理機(jī)制是動(dòng)脈粥樣硬化(Atherosclerosis，AS)[1]。研究[2]證實(shí)，AS是一種炎癥反應(yīng)，其特點(diǎn)為脂質(zhì)和膽固醇在大、中動(dòng)脈血管內(nèi)膜的聚集。炎癥反應(yīng)主要由動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞激活和白細(xì)胞滲透引起[3]，細(xì)胞因子和化學(xué)因子在其中發(fā)揮了很大的作用[1]，當(dāng)血液中富含載脂蛋白B(Apo-B)的脂蛋白濃度升高并在血管內(nèi)膜聚集時(shí)，內(nèi)皮細(xì)胞被激活并分泌多種細(xì)胞因子和化學(xué)因子，如單核細(xì)胞趨化蛋白-1(MCP-1)、巨噬細(xì)胞集落刺激因子(M-CSF)、轉(zhuǎn)錄生長(zhǎng)因子-β(TGF-β)等，招募血液中的單核巨噬細(xì)胞和T細(xì)胞滲入到血管內(nèi)膜；T 細(xì)胞進(jìn)入血管內(nèi)膜分化并分泌細(xì)胞因子提呈輔助性T細(xì)胞1(Th1) 和Th2，包括干擾素-γ(IFN-γ)、轉(zhuǎn)錄生長(zhǎng)因子-α(TGF-α)、白介素-12(IL-12)和腫瘤壞死因子-β(TNF-β)[4]。單核巨噬細(xì)胞分化成巨噬細(xì)胞并吞噬被修飾的低密度脂蛋白，即氧化型低密度脂蛋白(ox-LDL)，最終形成巨噬細(xì)胞源性泡沫細(xì)胞[5，6]。在巨噬細(xì)胞內(nèi)，被吞噬的ox-LDL合成膽固醇脂并聚集為脂滴，形成泡沫細(xì)胞，巨噬細(xì)胞的泡沫化一直被認(rèn)為是一個(gè)促炎反應(yīng)過程[7]。雖然對(duì)AS與炎癥反應(yīng)的研究較多，但是巨噬細(xì)胞泡沫化過程中炎性細(xì)胞相互作用如何引起炎癥反應(yīng)仍是目前探討的熱點(diǎn)。本實(shí)驗(yàn)觀察巨噬細(xì)胞泡沫化對(duì)炎癥反應(yīng)的影響。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物、主要試劑及儀器

C57BL/6J雄性小鼠(6-8周齡，體重22-25g)購(gòu)自武漢大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心，取其骨髓細(xì)胞用于巨噬細(xì)胞的分化。15% L929 培養(yǎng)液為15% 培養(yǎng)小鼠成纖維細(xì)胞系所得的上清液(含有M-CSF類似物)與85% IMDM液體培養(yǎng)基的混合物，IMDM液體培養(yǎng)基(貨號(hào)：SH30228.01B)購(gòu)自Hyclone公司，ox-LDL購(gòu)自美國(guó)Biomedical Technologies公司，乙二胺四乙酸(EDTA)粉 (貨號(hào)：E6758)、油紅染料粉(貨號(hào)：O9755)、10% 福爾馬林溶液(貨號(hào)：F8775)、TRIzol溶液(貨號(hào)：T9424)均購(gòu)自美國(guó)Sigma公司，熒光抗體CD11b(貨號(hào)：12-0112-41)、F4/80(貨號(hào)：12-0113-41)購(gòu)自美國(guó)eBioscience公司。60%異丙醇(貨號(hào)：IT7048)購(gòu)自上海生工公司。細(xì)胞濾網(wǎng)(貨號(hào)：352350)購(gòu)自中國(guó)Corning公司，牛巴氏計(jì)數(shù)板(貨號(hào)：717805)購(gòu)自廣州華奧瑞公司，C6流式細(xì)胞儀購(gòu)自美國(guó)BD Biosciences公司，Bio-Rad CFX384熒光定量檢測(cè)儀、q-PCR試劑盒(貨號(hào)：1725140)購(gòu)自美國(guó)Bio-Rad公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 骨髓細(xì)胞的獲取及計(jì)數(shù)：頸椎脫臼法處死實(shí)驗(yàn)小鼠后抽取骨髓細(xì)胞。用 70μm孔徑的細(xì)胞濾網(wǎng)過濾后加2倍體積紅細(xì)胞裂解液冰上裂解10min，400g離心5min取沉淀。用10ml含15% L929培養(yǎng)液重懸細(xì)胞。吸取細(xì)胞懸液10μl，滴滿牛巴氏計(jì)數(shù)板，10×10倍光鏡下計(jì)數(shù)骨髓細(xì)胞數(shù)/ml[=(四大格內(nèi)細(xì)胞總數(shù)/4)×104×稀釋倍數(shù)]。

1.2.2 骨髓細(xì)胞培養(yǎng)及巨噬細(xì)胞鑒定:將上述骨髓細(xì)胞用15% L929培養(yǎng)液制成2×106/ml懸液，加入12孔板中(每孔1 ml)。37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3天后更換新培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。6天后，用EDTA消化細(xì)胞，400g離心5min，PBS重懸后加入熒光抗體CD11b-PE和F4/80-FITC，常溫暗室孵育10min。400g離心5min，取沉淀用100μl PBS重懸。上流式細(xì)胞儀檢測(cè)培養(yǎng)細(xì)胞膜上標(biāo)志蛋白CD11b、F4/80的表達(dá)(CD11b和F4/80雙陽性為巨噬細(xì)胞)。本次培養(yǎng)骨髓細(xì)胞成功分化為巨噬細(xì)胞，其純度為98.1%，見圖1。

圖1 骨髓細(xì)胞培養(yǎng)分化為巨噬細(xì)胞的流式細(xì)胞圖

1.2.3 實(shí)驗(yàn)分組與處理:將成功分化的巨噬細(xì)胞用100%的IMDM培養(yǎng)液制成2×106/ml細(xì)胞懸液，加入不同濃度ox-LDL分成3組，包括空白對(duì)照組(0μg/ml)、10μg/ml組和25μg/ml組，混勻后加入12孔板，每組6個(gè)復(fù)孔，于37℃、5% CO2中培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h。

1.2.4 觀察巨噬細(xì)胞泡沫化：取出12孔板，PBS洗2次后10%福爾馬林固定30min，再用PBS洗2次后加入60%異丙醇，室溫放置5min。每孔加入500μl油紅染料(將30mg油紅粉末溶于10ml異丙醇中制成)，室溫放置10min后，用去離子水洗2次，10×25倍光鏡下觀察，泡沫化巨噬細(xì)胞內(nèi)聚集的脂滴經(jīng)油紅染料染成紅色。隨機(jī)選取10個(gè)視野，計(jì)數(shù)紅染細(xì)胞，并計(jì)算百分率。

1.2.5 IL-1β和TNF-α mRNA檢測(cè)：取出12孔板，PBS洗2次后，每孔加入500μl TRIzol裂解液，按常規(guī)方法提取細(xì)胞總RNA并測(cè)定RNA濃度，逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA。

各種引物序列見表1。實(shí)時(shí)熒光定量PCR：反應(yīng)體系共10μl，反應(yīng)條件：94 ℃ 5min預(yù)變性，95 ℃ 45s，60 ℃ 1min，40個(gè)循環(huán)，以β-actin作為內(nèi)參照同時(shí)設(shè)置空白對(duì)照。以PCR反應(yīng)前3-15個(gè)循環(huán)的熒光信號(hào)作為熒光本底信號(hào)，調(diào)節(jié)基線至適宜處，各熒光曲線與基線交叉點(diǎn)的循環(huán)數(shù)即為Ct值。以ΔΔCt表示目的基因mRNA相對(duì)表達(dá)量，ΔΔCt=2-(Ct目的基因-Ctβ-actin)，每組重復(fù)3次取平均值。

表1 各基因引物序列

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié) 果

2.1 各組巨噬細(xì)胞泡沫化程度

圖2顯示空白對(duì)照組紅染巨噬細(xì)胞(即泡沫化巨噬細(xì)胞)較少，隨著ox-LDL濃度增加，紅染巨噬細(xì)胞增多，25μg/ml組明顯多于10μg/ml組。定量分析表明三組間紅染細(xì)胞百分率差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=1190,P<0.01)。與空白對(duì)照組(2.04%±0.17%)相比，10μg/ml組(13.34%±0.48%)和25μg/ml組(31.62%±0.55%)巨噬細(xì)胞泡沫化程度均顯著增加(t=22.03和t=51.65，P均<0.01)，且25μg/ml組巨噬細(xì)胞泡沫化程度又明顯高于10μg/ml組(t=25.06，P<0.01)。

2.2 各組促炎因子水平

各組IL-1β和TNF-α的mRNA表達(dá)水平差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05或P<0.01)。IL-1β mRNA水平，10μg/ml組與空白對(duì)照組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；25μg/ml組較空白對(duì)照組和10μg/ml組顯著降低(t值分別為3.58和3.60，均P<0.05)。TNF-α mRNA水平，與空白對(duì)照組比較，10μg/ml組顯著下降(t=5.27，P<0.01)；25μg/ml組TNF-α mRNA表達(dá)水平雖較10μg/ml組有所升高，但仍低于空白對(duì)照組(t=3.67，P<0.05)。見表2。

[本文圖2見插1反面]

3 討 論

泡沫細(xì)胞是AS斑塊內(nèi)出現(xiàn)的特征性病理細(xì)胞，可視為AS形成的標(biāo)志。脂質(zhì)斑塊內(nèi)，由于分泌Th2細(xì)胞因子的免疫細(xì)胞相對(duì)較少，AS的炎癥反應(yīng)是以Th1驅(qū)動(dòng)為主的促炎反應(yīng)[8]。在AS血管內(nèi)膜，隨著LDL的聚集，一些先天性和后天性免疫細(xì)胞滲透到血管內(nèi)膜下，分泌一些細(xì)胞因子如IFN-γ、TGF-α，加速泡沫細(xì)胞的形成[9]。有研究[10，11]顯示，巨噬細(xì)胞低效清除ox-LDL能促進(jìn)自身和其它免疫細(xì)胞分泌促炎因子和化學(xué)因子，使更多免疫細(xì)胞被招募到內(nèi)膜，加速炎癥反應(yīng)進(jìn)程。但也有研究[12]顯示，體內(nèi)巨噬細(xì)胞源性泡沫細(xì)胞中促炎因子水平下調(diào)。Spann等[13]曾報(bào)道，巨噬細(xì)胞源性泡沫細(xì)胞可通過上調(diào)肝X受體(LXR)激活抗炎反應(yīng)。

表2 各組細(xì)胞IL-1β和TNF-α mRNA水平比較均=3)

注：與空白對(duì)照組比較，1)P<0.05，2)P<0.01；與10μg/ml組比較，3)P<0.05

本文通過體外實(shí)驗(yàn)檢測(cè)分析了ox-LDL對(duì)巨噬細(xì)胞泡沫化的影響。結(jié)果表明，10μg/ml和25μg/ml ox-LDL均能使巨噬細(xì)胞泡沫化，油紅染色結(jié)果顯示巨噬細(xì)胞內(nèi)有大量的脂滴聚集。且以25μg/ml組泡沫化程度更高，提示較高水平ox-LDL更利于巨噬細(xì)胞泡沫化。另外，本文進(jìn)一步檢測(cè)了巨噬細(xì)胞源性泡沫細(xì)胞中促炎因子IL-1β和TNF-α mRNA表達(dá)水平。結(jié)果顯示，與空白對(duì)照組比較，IL-1β mRNA的表達(dá)水平僅在25μg/ml組顯著降低，TNF-α在10μg/ml組和25μg/ml組的表達(dá)水平均顯著下降，表明泡沫細(xì)胞在10μg/ml ox-LDL處理時(shí)主要通過下調(diào)TNF-α來調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)進(jìn)程，在25μg/ml ox-LDL處理時(shí)可同時(shí)通過下調(diào)IL-1β和TNF-α來影響炎癥反應(yīng)的進(jìn)程。其具體機(jī)制有待繼續(xù)深入研究。

綜上所述，巨噬細(xì)胞源性泡沫細(xì)胞能顯著降低促炎因子分泌，繼而影響AS進(jìn)程，為AS的治療提供了依據(jù)。

?

本文第一作者簡(jiǎn)介：

宋 輝(1987-)，女，漢族，碩士研究生，研究方向?yàn)樾难芗膊“l(fā)生機(jī)制參考文獻(xiàn)

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Effect of Macrophage Derived Foam Cell on Inflammatory Responses

SONG Hui, YANG Fang#

Department of Physiology, Basic Medical School, Wuhan University, Wuhan 430079, China;#

Objective: To investigate the effect of macrophage derived foam cell on inflammatory responses.Method: Bone marrow cells from 6-8 weeks’ male C57BL/6J mice were treated with L929 for macrophage differentiation for 6 days. Then macrophage was treated with different concentration of oxidized low-density lipoprotein (ox-LDL)，divided into 3 groups: control group(0μg/ml),10μg/ml group and 25μg/ml group. The macrophage derived foam cells were stained by oil red O and the mRNA expression of pro-inflammatory cytokines IL-1β and TNF-α were measured by Real-time PCR.Results: The monocytes of bone marrow cells differentiated to macrophages successfully. Different concentration of oxLDL induced the foam cell formation and the effect of 25μg/ml group was greater than 10μg/ml group (P<0.01). Comparing to the control group, the mRNA expression of pro-inflammatory cytokines IL-1β and TNF-α was significantly decreased in 25μg/ml group (P<0.05).Conclusion: Macrophage derived foam cells have inhibitional effect on inflammatory responses.

Macrophage; Foam cell; Pro-inflammatory cytokines; Mice

國(guó)家自然科學(xué)基金(31170328, 30900122)

武漢大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院生理學(xué)系，武漢 430079；#

，E-mail：fang-yang@whu.edu.cn

本文2014-12-08收到，2015-01-13修回

R543.1

A

1005-1740(2015)02-0019-04