周曉玲 潘 磊 馬婷婷 郭 蕊 江 宏 姚小燕,4 高志敏 王 勇,#

通心絡(luò)對低壓低氧性肺動脈高壓大鼠HIF-1α及相關(guān)因子的作用*

周曉玲1,2潘 磊1,2馬婷婷1,2郭 蕊1,2江 宏1,2姚小燕1,2,4高志敏3王 勇1,2,#

目的：探討通心絡(luò)對低壓低氧性肺動脈高壓大鼠缺氧誘導(dǎo)因子-1α(HIF-1α)及相關(guān)因子的影響。方法：30只體重200-250g的SD雄性大鼠，隨機分為常壓常氧對照組(對照組)、低壓低氧模型組(模型組)、低壓低氧+通心絡(luò)干預(yù)組(通心絡(luò)干預(yù)組)，每組10只。采用低壓低氧艙模擬海拔5 000m的高原環(huán)境(大氣壓50kp，氧濃度10%)。模型組和通心絡(luò)干預(yù)組大鼠每日入艙8h，其余時間為常壓常氧環(huán)境。通心絡(luò)干預(yù)組每天入艙前給予通心絡(luò)1.2g生藥/kg灌胃1次，對照組于同一實驗室的常壓常氧環(huán)境中飼養(yǎng)。4周后比較各組大鼠平均肺動脈壓(mPAP)、右心室(RV)肥厚指數(shù)以及血清HIF-1α、血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)、內(nèi)皮素-1(ET-1)等因子水平。結(jié)果：4周后，與對照組相比，模型組大鼠mPAP、RV肥厚指數(shù)及HIF-1α、VEGF、ET-1等因子水平顯著升高(P<0.05)。與模型組相比，通心絡(luò)干預(yù)組大鼠mPAP、RV肥厚指數(shù)及血清HIF-1α、VEGF、ET-1等因子水平均顯著降低(P<0.05)，且RV肥厚指數(shù)及血清HIF-1α、ET-1水平與對照組水平差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。結(jié)論：通心絡(luò)可能通過降低HIF-1α水平等干預(yù)低壓低氧性肺動脈高壓的發(fā)生發(fā)展。

通心絡(luò)；低壓低氧性肺動脈高壓；缺氧誘導(dǎo)因子-1α；大鼠

低壓低氧性肺動脈高壓是高原病的表現(xiàn)類型之一，也是高原心臟病的基礎(chǔ)，其發(fā)生和發(fā)展嚴重威脅著高原地區(qū)人群的健康[1,2]，因此防治低壓低氧性肺動脈高壓具有重要意義。低壓低氧性肺動脈高壓發(fā)病機制復(fù)雜，有效的靶向治療藥物有限，治療效果也不確切[3,4]。而中醫(yī)中藥的作用研究有助于尋找新的治療途徑。

通心絡(luò)是根據(jù)中醫(yī)絡(luò)病理論研制而成的中藥復(fù)方制劑，由人參、水蛭、全蝎、土鱉蟲、蜈蚣、蟬蛻、赤芍、降香、乳香、冰片等組成。具有改善內(nèi)皮功能、抗氧自由基、抗動脈粥樣硬化，減輕心肌缺血-再灌注損傷等作用[5.6]。目前不僅廣泛用于心腦血管疾病治療[7,8]，而且對慢性肺源性心臟病的肺動脈高壓也有一定的療效，但鮮見對低壓低氧性肺動脈高壓防治的研究報道。本研究采用低壓低氧艙建立高原肺動脈高壓大鼠模型，觀測通心絡(luò)對大鼠血流動力學(xué)、缺氧誘導(dǎo)因子-1α(HIF-1α)及相關(guān)因子水平的影響，為通心絡(luò)防治低壓低氧性肺動脈高壓提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 藥品與試劑

通心絡(luò)超微粉由石家莊以嶺藥業(yè)股份有限公司生產(chǎn)(批號：090226)。大鼠HIF-1α ELISA試劑盒(批號：201310)、大鼠內(nèi)皮素-1(ET-1)ELISA試劑盒(批號：201310)、大鼠血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)ELISA試劑盒(批號：201310)均購自北京鑫方程生物技術(shù)有限公司。

1.2 主要儀器

低壓低氧艙由濰坊華信鍋爐氧艙制造有限公司生產(chǎn)(型號：DSF-II動物實驗負壓艙)。動物呼吸機(型號：HX-300S)、肺動脈壓力測定儀(型號：BL-420/820)均購自成都泰盟科技有限公司。聚乙烯塑料微導(dǎo)管(長20cm，直徑約2mm)由上海泰爾茂醫(yī)療有限公司提供。

1.3 實驗動物及分組

雄性SPF級SD大鼠30只(由北京維通利華實驗動物中心提供)，體重200-250g。應(yīng)用隨機數(shù)字表法分為常壓常氧對照組(對照組)、低壓低氧模型組(模型組)、低壓低氧+通心絡(luò)干預(yù)組(通心絡(luò)干預(yù)組)，每組各10只。通心絡(luò)干預(yù)組大鼠每天入艙前給予通心絡(luò)灌胃1次[參照相關(guān)研究結(jié)果[9]，通心絡(luò)干預(yù)劑量為1.2g生藥/kg/天。用0.5%羧甲基纖維素鈉(CMC-Na) 將其配制成濃度為0.12g生藥/ml混懸液，每次按0.1ml/10g體重灌胃]。對照組與模型組大鼠每天給予等量0.5%CMC-Na灌胃1次，共28天(次)。參照李娟等[10]低壓低氧性大鼠肺動脈高壓模型的建立的方法，每天灌胃后模型組與通心絡(luò)干預(yù)組大鼠同時置于低壓低氧艙，每天8h，模擬海拔5 000m高原環(huán)境(大氣壓50kp，氧濃度10%)，持續(xù)4周。對照組于同一實驗室內(nèi)的常壓常氧環(huán)境飼養(yǎng)4周。實驗期間各組大鼠均無死亡。

1.4 大鼠平均肺動脈壓(mPAP)測定

4周后，各組大鼠腹腔注射戊巴比妥鈉(40mg/kg)，麻醉后接動物呼吸機(呼吸頻率30次/min，潮氣量10ml/kg)。自大鼠右側(cè)頸外靜脈插入直徑2mm肝素化 (0.9%氯化鈉溶液+肝素10U/ml)的聚乙烯塑料微導(dǎo)管，導(dǎo)管的另一端與微型壓力傳感器連接以監(jiān)測壓力變化，在壓力波形的引導(dǎo)下，導(dǎo)管經(jīng)上腔靜脈進入右房、三尖瓣口、右室，最后進入肺動脈干，測定mPAP。當大鼠mPAP>35mmHg時，形成顯著的肺動脈高壓[11]。對照組大鼠mPAP水平為19.24±3.75mmHg(15.00-25.00mmHg)。模型組大鼠mPAP水平為45.46±3.17mmHg(40.00-48.00mmHg)，均形成肺動脈高壓。通心絡(luò)干預(yù)組大鼠mPAP水平為29.01±4.96mmHg(22.00-35.06mmHg)，僅1只大鼠形成了肺動脈高壓。

1.5 血清HIF-1α、VEGF、ET-1檢測

制模結(jié)束后從大鼠左頸總動脈采全血2ml，3 000r/min離心10min，制備血清。應(yīng)用ELISA法測定各組大鼠血清HIF-1α、VEGF、ET-1水平，操作嚴格按照試劑盒說明書。

1.6 右心室(RV)肥厚指數(shù)測定

大鼠采血后頸動脈放血法處死大鼠，剖胸取出大鼠心臟，觀察心臟結(jié)構(gòu)，剪去心房組織。沿室間隔邊緣分離出RV和左心室(LV)+室間隔(S)，用濾紙吸干水分后稱量RV和LV+S重量，以RV/(LV+S)比值表示RV肥厚程度。

1.7 統(tǒng)計學(xué)處理

2 結(jié) 果

2.1 各組mPAP和RV肥厚指數(shù)

三組間mPAP和RV肥厚指數(shù)的差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義(F值分別為97.21和14.24，P均<0.05)。模型組大鼠mPAP和RV肥厚指數(shù)較對照組顯著升高 (t值分別為15.74和4.29，均P<0.05)。通心絡(luò)干預(yù)組大鼠mPAP和RV肥厚指數(shù)較模型組明顯下降 (t值分別為8.35和3.60，均P<0.05)；其RV肥厚指數(shù)與對照組差異無統(tǒng)計學(xué)意義(t=0.83，P>0.05)。見表1。

表1 各組大鼠mPAP和RV肥厚指數(shù)比較均=10)

注:與對照組比較，1)P<0.05；與模型組比較，2)P<0.05

2.2 各組大鼠血清HIF-1α、VEGF、ET-1水平

三組間血清HIF-1α、VEGF、ET-1水平差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(F值分別為38.93、 95.32和 37.66，均P<0.01)。模型組大鼠血清HIF-1α、VEGF和ET-1水平較對照組明顯升高 (t值分別為12.86、18.98和11.12，均P<0.05)；通心絡(luò)干預(yù)組與模型組比較，HIF-1α、VEGF及ET-1水平顯著下降(t值分別為6.78、4.76和6.13，均P<0.05)，其HIF-1α、ET-1兩指標水平與對照組差異無統(tǒng)計學(xué)意義(t值分別為0.37和0.30，均P>0.05)。見表2。

表2 各組大鼠血清HIF-1α、VEGF、ET-1水平比較均=10)

注:與對照組比較，1)P<0.05；與模型組比較，2)P<0.05

3 討 論

在慢性缺氧條件下，機體會出現(xiàn)缺氧性肺血管收縮(Hypoxe Pulmonary Vasoconstriction, HPV)及肺血管重構(gòu)，形成持續(xù)缺氧性肺動脈高壓，進而導(dǎo)致右心室后負荷增加和右心室肥大，嚴重者可進一步發(fā)展為右心衰竭[12,13]。HIF-1α是缺氧條件下最重要的調(diào)節(jié)因子，可編碼多種血管收縮因子，導(dǎo)致VEGF、ET-1等在內(nèi)的血管收縮因子水平升高，不僅引起肺血管收縮和壓力升高，而且促進細胞有絲分裂，增強肺血管重塑[14,15]。本研究發(fā)現(xiàn)在模擬海拔5 000m的高原環(huán)境下，模型組大鼠mPAP和RV肥厚指數(shù)均明顯升高，血清HIF-1α、VEGF和ET-1水平也顯著上調(diào)，進一步驗證了低壓低氧性肺動脈高壓的形成機制。

有研究[16]表明，通心絡(luò)改善內(nèi)皮功能、抗氧自由基、減輕組織缺血-再灌注損傷的作用可能與其能影響HIF-1α的生物學(xué)效應(yīng)有關(guān)。本研究發(fā)現(xiàn)，與模型組大鼠相比，通心絡(luò)干預(yù)組大鼠mPAP和RV肥厚指數(shù)均顯著下降，表明通心絡(luò)能有效降低低壓低氧性肺動脈高壓大鼠mPAP，減輕右室重構(gòu)。另外，通心絡(luò)干預(yù)組大鼠血清HIF-1α、VEGF及ET-1水平明顯降低，提示通心絡(luò)可能通過下調(diào)HIF-1α的表達，抑制HIF-1α對下游靶基因產(chǎn)物VEGF、ET-1水平的上調(diào)作用，減少缺氧對內(nèi)皮細胞的損害，糾正血管收縮/舒張因子的動態(tài)失衡，減輕血管收縮和肺血管平滑肌增殖，抑制肺血管重構(gòu)，降低肺動脈壓，從而有效遏制低壓低氧性肺動脈高壓的發(fā)生發(fā)展[14,15]。

本研究結(jié)果提示通心絡(luò)可能通過降低血清HIF-1α及其相關(guān)血管收縮因子水平，干預(yù)低壓低氧性肺動脈高壓的發(fā)生或進程，但其更多的作用機制和安全性等有待進一步探討。

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本文第一作者簡介：

周曉玲(1982-)，女，漢族，醫(yī)學(xué)博士，研究方向：老年醫(yī)學(xué)與腎臟疾病、低氧醫(yī)學(xué)

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The Effect of Tongxinluo on HIF-1α and Related Factors Level in Rats with Hypobaric and Hypoxia Pulmonary Hypertension

ZHOU Xiao-ling1,2, PAN Lei1,2, MA Ting-ting1,2, GUO Rui1,2, JIANG Hong1,2, YAO Xiao-yan1,2,4, GAO Zhi-Min3, WANG Yong1,2,#

1Department of Geratology；2Hypoxia Laboratory；3Labor of Animal Experiment, Beijing Shijitan Hospital, Capital Medical University, Beijing 100038, China；4The Ninth Clinical Hospital of Peking University,Beijing 100038,China;#

Objective: To study the effect of Tongxinluo on HIF-1α in rats with hypobaric and hypoxia pulmonary hypertension.Method: 30 male SD rats weighing 200-250g were randomly divided into three groups: control group with normal pressure and normal oxygen(control group), pulmonary hypertension group with low-pressure and low-oxygen (model group), and the group treated by Tongxinluo in low-pressure and low-oxygen condition (Tongxinluo intervention group). Each group included 10 rats. Auto-modulating hypobaric and hypoxic cabin was used to simulate 5000m high altitude environment (air pressure 50kpa, oxygen concentration 10%). Tongxinluo (1.2g/kg crude drug) was given by gastrogavage to rats in Tongxinluo intervention group once daily. Control group were exposed to normal-pressure and normal-oxygen in the same laboratory environment. 4 weeks later, the mean pulmonary arterial pressure (mPAP) and right ventricular (RV) mass index were measured. Concentrations of HIF-1α, VEGF and ET-1 in blood were detected.Results: Compared with control group, mPAP, RV mass index and the levels of HIF-1α, VEGF, ET-1 in model group were significantly increased (P<0.05). Compared with model group, rats of Tongxinluo intervention group showed lower mPAP and RV mass index, and the levels of HIF-1α, VEGF and ET-1 decreased remarkably (P<0.05). There was no significant difference between control group and Tongxinluo intervention group in right ventricular hypertrophy index and the levels of serum HIF-1α and ET-1 (P> 0.05). Conclusion: Tongxinluo may influence the occurrence and development of hypobaric and hypoxia pulmonary hypertension by downregulated the level of HIF-1α.

Tongxinluo; Hypobaric and hypoxia pulmonary hypertension; Hypoxia-inducible factor-1α; Rat

北京市中醫(yī)藥科技項目(JJ2013-10)

首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京世紀壇醫(yī)院, 北京 100038；1老年醫(yī)學(xué)科；2低氧實驗室；3動物實驗中心；4北京大學(xué)第九臨床醫(yī)學(xué)院，北京 100038；#

，E-mail：wangyong7096@aliyun.com

本文2015-01-14收到，2015-02-15修回

R285.5

A

1005-1740(2015)02-0008-04