伍婷婷 曾 吉 張百芳 葉 鳳

蛋白激酶C-β抑制劑LY333531對(duì)1型糖尿病大鼠腎功能的影響*

伍婷婷1曾 吉1張百芳2葉 鳳2

目的：觀察蛋白激酶C(PKC)-β抑制劑LY333531對(duì)1型糖尿病大鼠腎功能的保護(hù)作用。方法：27只SD大鼠隨機(jī)分為正常對(duì)照組、糖尿病組和LY組，每組各9只。后兩組采用一次性尾靜脈注射60mg/kg鏈脲佐菌素(STZ)成功構(gòu)建1型糖尿病模型。LY組大鼠給予PKC-β抑制劑LY333531(10mg/kg/天)灌胃治療8周。抽取各組大鼠頸動(dòng)脈血并留取24h尿液，測(cè)量血糖、內(nèi)生肌酐清除率和24h尿蛋白。之后處死各組大鼠，摘取腎臟稱重并計(jì)算腎重/體重。統(tǒng)計(jì)學(xué)分析各組上述指標(biāo)的差異。結(jié)果：與正常對(duì)照組比較，糖尿病組和LY組大鼠的體重均明顯減輕，而腎重、腎重/體重、血糖及24h尿蛋白均顯著升高(P<0.05)；LY組大鼠的腎重/體重、內(nèi)生肌酐清除率及24h尿蛋白水平均低于糖尿病組(P<0.05)，兩組腎重、體重和血糖差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。結(jié)論：PKC-β抑制劑LY333531有利于改善1型糖尿病大鼠內(nèi)生肌酐清除率和減少蛋白尿的產(chǎn)生。

糖尿??； 蛋白激酶C-β抑制劑LY333531； 腎功能； 大鼠

糖尿病腎病(Diabetic Nephropathy，DN)是糖尿病危害性最大的慢性并發(fā)癥之一，其發(fā)病機(jī)制極為復(fù)雜。在1型和2型糖尿病患者中，高血糖是導(dǎo)致DN發(fā)生的一個(gè)重要原因。長(zhǎng)期高血糖環(huán)境可誘導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)糖基化終末代謝產(chǎn)物增加，氧化應(yīng)激、多元醇通路以及蛋白激酶C(Protein Kinase，PKC)信號(hào)途徑激活。而這些病理途徑又相互影響、逐級(jí)放大，最終發(fā)展至終末期腎病[1]。因此，抑制PKC活化可能是減少腎臟損害、防治DN發(fā)生的策略之一。本實(shí)驗(yàn)以鏈脲佐菌素(STZ)誘導(dǎo)SD大鼠1型糖尿病模型后，應(yīng)用PKC-β抑制劑LY333531對(duì)模型大鼠進(jìn)行灌胃治療，觀察其腎功能改變，為PKC-β抑制劑治療DN提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物、試劑和儀器

200-250g雄性SD大鼠(武漢大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，許可證號(hào)SCXK 2008-0004)。STZ(美國(guó)Sigma公司，貨號(hào)S0130)，PKC-β抑制劑LY333531(美國(guó)禮來(lái)公司，貨號(hào)A1401)，血糖檢測(cè)試劑盒(德國(guó)西門(mén)子公司，批號(hào)07193)，肌酐檢測(cè)試劑盒(武漢長(zhǎng)新盛生物技術(shù)有限公司，批號(hào)071504017)，尿蛋白測(cè)定試劑盒(德國(guó)西門(mén)子公司，批號(hào)19018)，其它試劑均為國(guó)產(chǎn)或進(jìn)口分析純。自動(dòng)生化分析儀(德國(guó)西門(mén)子公司，型號(hào)Advial 2400)。

1.2 1型糖尿病大鼠模型的構(gòu)建和分組

27只SD大鼠常規(guī)飼養(yǎng)一周后，采用隨機(jī)抽簽法分為三組：正常對(duì)照組、糖尿病組和LY組，每組各9只。糖尿病組和LY組采用一次性尾靜脈注射60mg/kg STZ(以0.1mol/L、pH 4.5的無(wú)菌檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液為溶劑)構(gòu)建1型糖尿病模型，對(duì)照組注射等量檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液。72h后測(cè)其血糖濃度>16.7mmol/L，為1型糖尿病造模成功[2]。糖尿病組和LY組18只大鼠均造模成功。成模后，LY組灌胃給予PKC-β抑制劑LY333531(10mg/kg，以0.9%氯化鈉注射液為溶劑，1次/天)，連續(xù)8周。正常對(duì)照組和糖尿病組灌胃等量生理鹽水。每天測(cè)定血糖、體重，記錄大鼠的飲食和飲水量。

1.3 觀察指標(biāo)和方法

1.3.1 24h尿肌酐和尿蛋白：三組大鼠均在處死前兩天進(jìn)入代謝籠，收集24h尿液，準(zhǔn)確記錄24h尿量，充分混勻后取5ml保存于-20℃冰箱，檢測(cè)24h尿蛋白和尿肌酐含量。

1.3.2 血糖、血肌酐和內(nèi)生肌酐清除率：實(shí)驗(yàn)結(jié)束前大鼠禁食12h，經(jīng)戊巴比妥鈉麻醉后頸動(dòng)脈取血，離心，收集血清保存于-20℃冰箱中，檢測(cè)血糖和血肌酐含量，并計(jì)算內(nèi)生肌酐清除率(ml/min)[=尿肌酐×每分鐘尿量/血肌酐]。

1.3.3 腎重/體重：實(shí)驗(yàn)結(jié)束后處死大鼠，迅速取出腎臟，去除包膜，生理鹽水沖洗干凈后吸干表面水分，無(wú)菌稱重，計(jì)算腎重/體重。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié) 果

實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)各組大鼠各指標(biāo)差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。與正常對(duì)照組比較，糖尿病組和LY組大鼠體重減輕(t=-28.957、-28.671，P<0.05)，腎臟重量增加(t=4.293、3.060，P<0.05)，腎重/體重升高(t=5.870、5.513，P<0.05)，血糖水平升高(t=24.284、14.325，P<0.05)，24h尿蛋白增加(t=12.964、9.702，P<0.05)。糖尿病組大鼠的內(nèi)生肌酐清除率高于正常對(duì)照組(t=3.717，P<0.05)。而LY組大鼠腎重/體重、內(nèi)生肌酐清除率和24h尿蛋白水平低于糖尿病組(t=-2.421、-2.684、-3.730，P<0.05)，且內(nèi)生肌酐清除率水平與正常對(duì)照組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=1.184，P>0.05)。糖尿病組與LY組腎重、體重和血糖水平差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=1.226、1.657、0.065，P>0.05)。見(jiàn)表1。

3 討 論

近年來(lái)隨著糖尿病發(fā)病率逐年上升，DN已成為世界范圍內(nèi)引起終末期腎病的首要原因[3]，其主要病理特征表現(xiàn)為腎小球?yàn)V過(guò)功能降低、腎小球足細(xì)胞損傷、大量蛋白尿、系膜基質(zhì)增多、進(jìn)行性腎小球纖維化等[4]。但DN的發(fā)病機(jī)制仍不十分清楚，糖代謝紊亂、血流動(dòng)力學(xué)異常、細(xì)胞因子過(guò)表達(dá)都可能參與DN的發(fā)生和發(fā)展[5]。目前臨床治療DN的主要方法是控制血糖和血壓，但其療效存在一定的局限性。因此，尋找更有效的防治DN的方法十分必要。

表1 8周后各組大鼠相關(guān)指標(biāo)水平

注：與正常對(duì)照組比較，1)P<0.05；與糖尿病組比較，2)P<0.05

有研究發(fā)現(xiàn)糖代謝異常和血流動(dòng)力學(xué)變化均可促進(jìn)腎臟PKC的表達(dá)，參與DN的病理過(guò)程[1]。高血糖誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激與糖尿病及其并發(fā)癥密切相關(guān)，而氧化應(yīng)激引起尼克酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(Nicotinamide Dinucleotide Phosphate，NADPH)氧化酶大量激活，誘導(dǎo)產(chǎn)生過(guò)量活性氧(Reactive Oxygen Species，ROS)的過(guò)程依賴于PKC的活化[6]?，F(xiàn)已發(fā)現(xiàn)PKC大約有12種結(jié)構(gòu)和底物不同的異構(gòu)體，其中研究最多的是傳統(tǒng)型PKC 亞基(PKC-α和PKC-β)。活化的PKC-β可通過(guò)各種信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑上調(diào)腎臟多種細(xì)胞因子的表達(dá)，包括血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(Vascular Endothelial Growth Factor，VEGF)、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β1(Tansforming Growth Factor-β1，TGF-β1)等[7,8]。已有研究表明TGF-β1和VEGF是參與腎小球細(xì)胞外基質(zhì)大量積聚、腎小球纖維化以及蛋白尿形成過(guò)程中重要的細(xì)胞因子[9]。Ohshiro等[10]研究發(fā)現(xiàn)敲除實(shí)驗(yàn)小鼠PKC-β基因能夠明顯減輕糖尿病小鼠腎臟的氧化損傷，下調(diào)多種細(xì)胞因子(內(nèi)皮素-1、TGF-β、VEGF及結(jié)締組織生長(zhǎng)因子)的表達(dá)、改善腎小球結(jié)構(gòu)異常、減少蛋白尿的發(fā)生。因此提示，抑制PKC-β活化和表達(dá)在一定程度上可延緩糖尿病腎臟結(jié)構(gòu)和功能的病理改變。

LY333531是一種PKC-β亞基選擇性抑制劑，本實(shí)驗(yàn)通過(guò)建立糖尿病大鼠模型觀察了LY333531對(duì)糖尿病大鼠腎功能的保護(hù)作用。結(jié)果顯示，糖尿病大鼠經(jīng)LY333531灌胃治療8周后，其內(nèi)生肌酐清除率和24 h尿蛋白明顯低于糖尿病組，提示LY333531可減少糖尿病大鼠尿蛋白排泄，改善腎功能紊亂。其作用可能與LY333531通過(guò)抑制PKC-β活化，減少腎臟氧化損傷，下調(diào)細(xì)胞因子表達(dá)，減輕腎臟纖維化和蛋白尿有關(guān)[11]。另外，本實(shí)驗(yàn)還發(fā)現(xiàn)LY組大鼠的腎重/體重低于糖尿病組，提示LY333531對(duì)早期糖尿病腎臟肥大有一定的抑制作用。上述結(jié)果與Kelly等[12,13]報(bào)道LY333531通過(guò)抑制PKC活化，下調(diào)腎組織中VEGF及TGF-β1表達(dá)，改善糖尿病大鼠蛋白尿和腎臟病理變化，以及LY333531能夠抑制糖尿病腎臟氧化應(yīng)激，通過(guò)抑制NADPH氧化酶和超氧化物歧化酶(Superoxide Dismutase，SOD)活性，減少ROS產(chǎn)生，發(fā)揮對(duì)腎臟保護(hù)作用[14]相符合。

綜上所述，PKC活化在DN的病理過(guò)程中起重要作用。本文結(jié)果表明應(yīng)用PKC-β抑制劑LY333531治療后，糖尿病大鼠腎功能有所改善，為臨床治療和預(yù)防DN提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。但DN發(fā)病機(jī)制極其復(fù)雜，LY333531作用靶標(biāo)和機(jī)制尚需進(jìn)一步研究。

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本文第一作者簡(jiǎn)介：

伍婷婷(1987-)，女，漢族，碩士研究生，研究方向?yàn)樘悄虿∧I病的分子機(jī)制

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氫氣飽和生理鹽水抑制ROS/ NF-κB通路激活、減輕重癥急性胰腺炎大鼠腎損傷

本刊副主編，武漢大學(xué)人民醫(yī)院王衛(wèi)星教授(通訊作者)指導(dǎo)石喬(第一作者)等在《Mediators of Inflammation》(2015，Article ID 685043，3區(qū)，IF=3.236)發(fā)表了題為“Hydrogen-rich saline attenuates acute renal injury insodium taurocholate-induced severe acute pancreatitis by inhibiting ROS and NF-κB pathway”的研究論文，主要內(nèi)容如下：

1 研究背景和目的：氫氣能夠選擇性地清除羥自由基(·OH)及過(guò)氧亞硝基陰離子(ONOO-)，不影響機(jī)體內(nèi)正常新陳代謝發(fā)生的氧化還原反應(yīng)及活性氧(ROS)參與的細(xì)胞信號(hào)通路。重癥急性胰腺炎時(shí)機(jī)體內(nèi)大量ROS的產(chǎn)生及其激發(fā)的炎癥級(jí)聯(lián)反應(yīng)，可損傷腎功能，甚至引起腎衰竭。本研究通過(guò)靜脈注射氫氣飽和生理鹽水(HRS)，觀察其對(duì)重癥急性胰腺炎大鼠腎損傷的保護(hù)作用，并探討其保護(hù)機(jī)制。

2 主要方法：雄性Wistar大鼠72只，隨機(jī)分為假手術(shù)組(SO組)、重癥急性胰腺炎組(SAP組)和HRS治療組(HRS組)，每組24只。膽胰管逆行注射5%?；悄懰徕c制備重癥急性胰腺炎模型。HRS組在造模成功后5min尾靜脈注射HRS(6ml/kg),并皮下HRS補(bǔ)液(20ml/kg)。SO組、SAP組造模成功后5min經(jīng)尾靜脈注射生理鹽水(6ml/kg),并皮下生理鹽水補(bǔ)液(20ml/kg)。術(shù)后3、12、24h分批剖殺大鼠，每個(gè)時(shí)間點(diǎn)8只。分別檢測(cè)各組大鼠各時(shí)間點(diǎn)血清淀粉酶(AMY)、脂肪酶(LIP)、肌酐(Cr)、尿素氮(BUN)、白細(xì)胞介素1β(IL-1β)及IL-6水平。取新鮮腎臟組織檢測(cè)丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)及髓過(guò)氧化物酶(MPO)水平。取腎臟組織病理切片行光鏡觀察及病理評(píng)分。采用免疫組化法檢測(cè)3-硝基酪氨酸及核因子-κB(NF-κB)在腎臟組織中的表達(dá)。Western Blot檢測(cè)NF-κB、IκB、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、IL-10、高遷移率族蛋白1(HMGB1)在腎臟組織中的表達(dá)。

3 結(jié)果：HRS組大鼠血清AMY水平與SAP組相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；HRS組大鼠血清(術(shù)后3h的Cr及BUN除外)Cr、BUN、IL-1β及IL-6較SAP相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)顯著降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。HRS組大鼠腎臟MDA、MPO水平較SAP組相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)顯著降低，SOD活性較SAP組相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)顯著升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。胰腺的病理評(píng)分及腎臟的病理評(píng)分較SAP組相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)顯著降低(P<0.05)。HRS 12h組腎臟組織中3-硝基酪氨酸、NF-κB(胞核)及TNF-α、HMGB1表達(dá)較SAP 12h顯著降低。相反，HRS 12h組腎臟組織中IL-10的表達(dá)較SAP 12h顯著升高(P<0.05)。

4 結(jié)論：HRS對(duì)重癥急性胰腺炎腎損傷具有保護(hù)作用，其機(jī)制與抗氧化應(yīng)激、抑制IκB硝化、降解及抑制NF-κB激活，從而減少下游炎性因子的產(chǎn)生有關(guān)。

Effects of Protein Kinase C-β Inhibitor LY333531 on Renal Function in Diabetic Rats

WU Ting-ting1, ZENG Ji, ZHANG Bai-fang2, YE Feng2

1Department of Clinical Laboratory, Puai Hospital, Wuhan 430034, China;2Department of Biochemistry, School of Medicine, Wuhan University, Wuhan 430071, China

Objective:To investigate the renoprotective effects of protein kinase C(PKC)-β inhibitor LY333531 in type 1 diabetic rats. Method:Twenty-seven Sprague-Dawley (SD) rats were randomized into three groups:normal control group, diabetic group and diabetic with LY333531 treatment group. Both of diabetic group and diabetic with LY333531 treatment group rats were injected intraperitoneally with 60 mg/kg streptozotocin (STZ) to induce type 1 diabetes. The LY treatment group rats were treated with LY333531 (10mg/kg/day) for eight weeks by gavage. After carotid artery blood and 24-hour urine of each group collected, blood glucose, creatinine clearance rate and 24-hour urine protein levels were measured. Meanwhile body weight and kidney weight was examined. All the indicators in three groups were analyzed by using statistics. Results:Both diabetic group and LY treatment group rats had higher kidney weight, kidney weight/body weight, blood glucose and 24-hour urine protein levels than normal control group (P<0.05). But body weight in diabetic group and LY treatment group rats were lighter than normal control group (P<0.05).The kidney weight/body weight, creatinine clearance rate and 24-hour urine protein levels of LY treatment group rats were significantly decreased compared with diabetic group (P<0.05). Besides, there was no significant difference in kidney weight, body weight and blood glucose between LY treatment group and diabetic group (P>0.05). Conclusion:The PKC-β inhibitor LY333531 may be used therapeutically to improve creatinine clearance rate and proteinuria of type 1 diabetic rats.

Diabetes; Protein kinase C-β inhibitor LY333531; Renal function; Rat

武漢市衛(wèi)計(jì)委科研基金項(xiàng)目(WX13C17)

1武漢市普愛(ài)醫(yī)院檢驗(yàn)科，武漢 430034；2武漢大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院生物化學(xué)與分子生物學(xué)系，武漢 430071

本文2015-03-23收到，2015-06-12修回

R587.1

A

1005-1740(2015)03-0013-04