楊光燃 楊芳遠(yuǎn) 曹 曦 楊金奎

促甲狀腺激素受體可在微血管內(nèi)皮細(xì)胞表達(dá)*

楊光燃 楊芳遠(yuǎn) 曹 曦 楊金奎

目的：檢測(cè)促甲狀腺激素受體(TSHR)在小鼠腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞(bEnd.3)的表達(dá)。方法：取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期bEnd.3細(xì)胞，采用RT-PCR和Western Boltting方法檢測(cè)bEnd.3細(xì)胞TSHR mRNA和蛋白表達(dá)水平。結(jié)果：bEnd.3 細(xì)胞總RNA濃度為2.9186μg/μl，A260/A280為1.97。TSHR mRNA的擴(kuò)增效率為96.41%±0.82%，溶解曲線呈單峰，相對(duì)表達(dá)量為0.64±0.14(相對(duì)睪丸組織)。電泳結(jié)果顯示bEnd.3 細(xì)胞能清晰表達(dá)TSHR mRNA。Western Blotting顯示bEnd.3細(xì)胞可以檢測(cè)到TSHR的α和β亞基蛋白表達(dá)，β亞基相對(duì)表達(dá)量為0.46±0.05(相對(duì)β-actin)。結(jié)論：小鼠腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞可表達(dá)TSHR，該結(jié)果有助于臨床研究TSH對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞功能的影響。

促甲狀腺激素受體； 微血管； 內(nèi)皮細(xì)胞

促甲狀腺激素(Thyroid Stimulating Hormone, TSH)是由垂體促甲狀腺細(xì)胞合成的一種異三聚體糖蛋白，主要靶器官為甲狀腺，通過與甲狀腺細(xì)胞表面TSH受體 (Thyroid Stimulating Hormone Receptor, TSHR) 結(jié)合來調(diào)節(jié)甲狀腺細(xì)胞的生長(zhǎng)、增殖和分化。有研究者通過RT-PCR等技術(shù)證實(shí)，TSHR除了存在于甲狀腺濾泡細(xì)胞膜外，尚存在于多種甲狀腺外組織細(xì)胞，如大腦組織、眼外肌、腎臟、睪丸等[1-5]。但是腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞上是否有TSHR表達(dá)鮮有研究報(bào)道。本文檢測(cè)小鼠腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞(bEnd.3)TSHR mRNA和蛋白表達(dá)水平，為TSH與腦微血管關(guān)系的機(jī)制研究提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞、主要試劑與儀器

bEnd.3細(xì)胞購(gòu)自美國(guó)ATCC公司。睪丸組織取自成年C56BL/6小鼠(n=3)。DMEM培養(yǎng)基(批號(hào)11995-065)、超純RNA提取試劑盒(批號(hào)CW0581)、HiFi-MMLV cDNA第一鏈合成試劑盒(批號(hào)CW0744)、SYBR PCR 預(yù)混體系(批號(hào) CW0956)、DNase 1(批號(hào)CW2090)、BCA蛋白定量試劑盒(批號(hào)02912E)均為美國(guó)CWbio公司產(chǎn)品；蛋白酶抑制劑(批號(hào)04693116001，美國(guó)Roche公司)；TSHR抗體(批號(hào)SC-13936，美國(guó)Santa Cruz公司)；β-actin(批號(hào)TA-09，中杉金橋公司)；RIPA蛋白抽提試劑(批號(hào)R00010，北京索萊寶公司)。PCR儀(Linegen型，杭州博日公司)；電泳儀(HT-Sub02型，北京鴻濤基業(yè))。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)：采用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)bEnd.3細(xì)胞至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，接種于10ml培養(yǎng)瓶中(n=3)，置于37℃、5% CO2細(xì)胞恒溫孵育箱內(nèi)培養(yǎng)，待細(xì)胞覆蓋瓶底約80%后吸出培養(yǎng)液，用1M PBS漂洗1次，0.05%胰酶-EDTA消化液消化細(xì)胞，離心后再用1M PBS漂洗1次。所得細(xì)胞用于TSH mRNA和蛋白水平的檢測(cè)。

1.2.2 PCR引物設(shè)計(jì)： TSHR和內(nèi)參GAPDH基因引物根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)RT-PCR引物原則設(shè)計(jì)，TSHR引物序列參照文獻(xiàn)[6]，由Invitrogen公司合成。見表1。

表1 TSHR引物和內(nèi)參引物

1.2.3 RT-PCR檢測(cè)TSH mRNA相對(duì)表達(dá)量：按照RNA提取試劑盒說明書提取RNA。bEnd.3 細(xì)胞總RNA濃度為2.9186μg/μl，A260/A280為1.97，純度較高。按照HiFi-MMLV cDNA第一鏈合成試劑盒說明書，反應(yīng)體系為：引物 2μl、RNA 模板 2μl、加RNase-Free water至15μl，65℃孵育5min，迅速冰浴，短暫離心(12 000rpm,4℃)。繼續(xù)向以上反應(yīng)液中加入以下試劑：5×RT混合液 4μl、HiFi-MMLV酶混合液 1μl，混勻，37℃孵育40min。反應(yīng)結(jié)束后70℃保溫10min。SYBR PCR擴(kuò)增，按說明書進(jìn)行，反應(yīng)體系為：SYBR PCR 預(yù)混體系(2×) 10μl，上、下游引物(10μM)各1μl，模板 2μl，加入滅菌蒸餾水至20μl。擴(kuò)增程序?yàn)椋?5℃ 10min， 95℃ 15s后，59℃ 60s，45個(gè)循環(huán)。每個(gè)樣本設(shè)2個(gè)復(fù)孔，采用2-△△ct方法計(jì)算bEnd.3 細(xì)胞和睪丸組織的mRNA表達(dá)量，再將睪丸組織的TSHR mRNA表達(dá)量設(shè)定為1，計(jì)算bEnd.3 細(xì)胞的TSHR mRNA相對(duì)表達(dá)量。

1.2.4 Western Blotting檢測(cè)TSHR蛋白表達(dá)：待測(cè)樣本中加入預(yù)冷RIPA蛋白抽提試劑，加入蛋白酶抑制劑進(jìn)行蛋白抽提，取上清，用BCA法定量測(cè)定蛋白濃度。配制10%分離膠，濃縮膠濃度為5%。待測(cè)蛋白樣品上樣量30μg/孔。電泳條件：濃縮膠恒壓90V，約20min；分離膠恒壓120V，約90min。濕轉(zhuǎn)法300mA恒流轉(zhuǎn)膜100min。封閉：將膜完全浸沒于5%BSA-TBST中，水平搖床孵育1h(RT)。一抗孵育4℃過夜，次日TBST洗膜3次，每次10min。二抗孵育，山羊抗兔IgG(H+L)HRP和山羊抗鼠IgG(H+L)HRP 1∶10 000，室溫孵育 40min。TBST洗膜3次，每次10min。ECL滴加到膜的蛋白面，反應(yīng)3-5min；膠片曝光顯影。每個(gè)樣本設(shè)2個(gè)復(fù)孔，以目標(biāo)蛋白與β-actin電泳條帶的灰度比值作為該蛋白的相對(duì)表達(dá)量。

2 結(jié) 果

2.1 bEnd.3細(xì)胞TSHR mRNA表達(dá)量

TSHR mRNA的擴(kuò)增效率(96.41%±0.82%)較高，溶解曲線呈單峰，特異性強(qiáng)，見圖1。定量分析結(jié)果表明bEnd.3細(xì)胞TSHR mRNA相對(duì)表達(dá)量為0.64±0.14。電泳結(jié)果顯示，bEnd.3 細(xì)胞能清晰表達(dá)TSHR mRNA(圖2)。

2.2 bEnd.3細(xì)胞TSHR 蛋白表達(dá)量

bEnd.3細(xì)胞經(jīng)Western Blotting電泳可以檢測(cè)到抗體說明書上標(biāo)示的TSHR的β亞基(42kd)和 α亞基(62kd)，而睪丸組織只檢測(cè)到β亞基(圖3)。電泳條帶灰度分析顯示bEnd.3 細(xì)胞TSHR β亞基蛋白相對(duì)表達(dá)量為0.46±0.05，低于睪丸組織TSHR β亞基蛋白的相對(duì)表達(dá)量(0.72±0.06)。

圖1 TSHR mRNA擴(kuò)增(上圖)、溶解(下圖)曲線

圖2 bEnd.3細(xì)胞TSHR mRNA電泳圖

圖3 bEnd.3 細(xì)胞TSHR蛋白電泳圖

3 討 論

以往研究認(rèn)為TSHR主要表達(dá)于甲狀腺、眼外肌、大腦的某些特定部位[1-3]、腎臟以及睪丸[4-6]。本研究發(fā)現(xiàn)TSHR可表達(dá)于小鼠腦部微血管內(nèi)皮細(xì)胞。

TSHR在多種組織細(xì)胞的表達(dá)，可能與其對(duì)不同組織細(xì)胞的作用有關(guān)。近年研究發(fā)現(xiàn)亞臨床甲狀腺功能減退癥(Subclinical Hypothyroidism, SCH)患者的血清TSH水平升高而甲狀腺激素正常這種狀態(tài)，與血管功能受損[7]、心功能障礙[8]等有關(guān)，因此認(rèn)為，SCH與高血壓、高脂血癥、高血糖等一樣，是缺血性心臟病的獨(dú)立危險(xiǎn)因素[9]，而且可能增加冠心病事件及冠心病死亡風(fēng)險(xiǎn)[10]。另有研究報(bào)道，甲狀腺功能正常人群，其TSH水平升高與冠心病患者頸動(dòng)脈內(nèi)膜中層厚度[11]、心力衰竭預(yù)后[12]、總膽固醇水平[13]、老年男性代謝綜合征的患病風(fēng)險(xiǎn)[14]均有關(guān)。部分原因可能是TSH參與肝臟的膽固醇代謝[15]及甘油三酯代謝[16，17]。

關(guān)于微血管內(nèi)皮細(xì)胞上是否有TSHR表達(dá)鮮有研究報(bào)道。已有的研究證實(shí)肝細(xì)胞和臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞上可檢測(cè)到TSHR表達(dá)[16，18]。還有臨床研究將127例合并SCH患者與隨機(jī)選擇的甲狀腺功能正常2型糖尿病患者進(jìn)行比較，結(jié)果發(fā)現(xiàn)前者有較高的糖尿病視網(wǎng)膜病變患病率，特別是威脅視力的視網(wǎng)膜病變[19]。另一項(xiàng)病例對(duì)照研究也證實(shí)，增殖型視網(wǎng)膜病變患者有較高的SCH患病率，并且在校正性別、年齡、糖化血紅蛋白等因素后兩者仍呈正相關(guān)，而且增殖型視網(wǎng)膜病變合并糖尿病腎病患者在進(jìn)一步校正尿白蛋白排泄率和血肌酐后，增殖型視網(wǎng)膜病變?nèi)耘cTSH升高有關(guān)[20]。

目前有關(guān)TSH水平升高增加微血管病變風(fēng)險(xiǎn)的機(jī)制尚不明確。本研究通過RT-PCR和Western Blotting發(fā)現(xiàn)小鼠腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞可表達(dá)TSHR mRNA和蛋白。該結(jié)果可能有助于進(jìn)一步探討TSH對(duì)微血管內(nèi)皮細(xì)胞的影響及其作用機(jī)制。

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本文第一作者簡(jiǎn)介：

楊光燃(1972—)，女，漢族，博士，副主任醫(yī)師，研究方向?yàn)樘悄虿〖捌洳l(fā)癥

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Expression of Thyroid Stimulating Hormone Receptor on Microvascular Endothelial Cells

YANG Guang-ran, YANG Fang-yuan, CAO Xi, YANG Jin-kui

Department of Endocrinology, Beijing Tongren Hospital, Capital Medical University, Beijing 100730, China

Objective:To evaluate the expression of thyroid stimulating hormone receptor (TSHR) on mouse microvascular endothelial cells (bEnd.3). Method:Real-time PCR and Western-boltting were used to analyze the expression of TSHR mRNA and TSHR protein in the bEnd.3 cells.Results:TSHR mRNA expression was detected in the bEnd.3 cells. The content of RNA in the bEnd.3 cells was 2.9186μg/μl, and its ratio of A260/A280 was 1.97. TSHR was amplified and the amplification efficiency was 96.41%±0.82%. Dissociation curve from real-time PCR was unimodal. The relative quantity of TSHR mRNA in the bEnd.3 cells was 0.64±0.14, when the quantity of TSHR mRNA in the testicle was set as 1.0. TSHR α and β subunit were detected by Western-blotting. The protein ratio of TSHRβ/β-actin was 0.46±0.05 in the gray scale analysis.Conclusion:The expression of TSHR could be found in the bEnd.3 cells. This finding may be helpful to explore the effect of thyroid stimulating hormone on microvascular endothelial cells.

Thyroid stimulating hormone receptor； Microvascular； Endothelial cell

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(81471009)；北京市衛(wèi)生系統(tǒng)高層次衛(wèi)生技術(shù)人才培養(yǎng)計(jì)劃(2014-3-013)；首都醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)臨床科研合作課題(14JL46)

首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京同仁醫(yī)院內(nèi)分泌科，北京 100730

本文2015-04-21收到，2015-06-24修回

R581

A

1005-1740(2015)03-0009-04