石玉婷 周陳陳 王 鎂 于世家

糖腎安對(duì)早期糖尿病大鼠耳廓及腎臟微循環(huán)血流量的影響*

石玉婷1周陳陳1王 鎂2，#于世家2

目的：應(yīng)用激光散斑成像(LSI)技術(shù)觀察中藥復(fù)方糖腎安煎劑對(duì)早期糖尿病(DM)大鼠耳廓及腎臟血流量的影響。方法：30只SD大鼠，采用高糖高脂飲食喂飼4周并一次性腹腔注射小劑量鏈脲佐菌素(STZ，35mg/kg)建立DM大鼠模型，將成模的28只大鼠隨機(jī)分為DM模型組(n=9)、西藥治療組(胰激肽原酶腸溶片治療，n=9)和中藥治療組(糖腎安煎劑治療，n=10)，另選10只SD大鼠作為正常對(duì)照組。藥物治療8周后，用moor FLPI-2 全景激光灌注成像儀監(jiān)測(cè)各組大鼠耳廓及腎臟微循環(huán)血流量變化。結(jié)果：DM模型組大鼠耳廓及腎臟血流量為133.42±49.58LSPU和297.19±39.43LSPU，正常對(duì)照組為70.04±7.28LSPU和239.27±33.27LSPU；中藥治療組為 77.11±14.16LSPU和253.6±35.57LSPU，西藥治療組為82.71±14.03LSPU和248.96±39.26LSPU。DM模型組上述檢測(cè)值均高于正常對(duì)照組(P<0.01)；中藥治療組和西藥治療組上述檢測(cè)值均顯著低于DM模型組(P<0.01)；中藥治療組、西藥治療組和正常對(duì)照組組間血流量差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。結(jié)論：糖腎安煎劑能明顯減輕早期DM大鼠微循環(huán)障礙引起的微血管血流量增加，其效果與胰激肽原酶相當(dāng)。

糖腎安煎劑；胰激肽原酶腸溶片；激光散斑成像技術(shù)；微循環(huán)血流量；糖尿病大鼠

微循環(huán)是血液與組織細(xì)胞進(jìn)行物質(zhì)交換的場(chǎng)所,微循環(huán)障礙是糖尿病(DM)微血管并發(fā)癥的共同通路,且出現(xiàn)較早,甚至在DM發(fā)病前的胰島素抵抗期就已經(jīng)存在,可能參與了DM的整個(gè)發(fā)展過程[1]。糖尿病腎病(DN)是DM常見的慢性微血管并發(fā)癥之一，也是DM的主要死亡原因之一[2]。DN的早發(fā)現(xiàn)、早診斷和早治療極為重要。組織血流量檢測(cè)可直接反映其微循環(huán)，包括腎臟微血管血流灌注狀態(tài)，為臨床診斷和防治提供依據(jù)。激光散斑成像 (Laser Speckle Imaging， LSI)技術(shù)，如全景激光灌注成像儀可進(jìn)行組織表面血流灌注監(jiān)測(cè),已被用于研究皮膚[3]、大腦皮層[4-5]、肝臟[6-7]、回腸[8]等組織器官的表層血流變化,但少有運(yùn)用此技術(shù)觀察腎臟表面微循環(huán)血流變化的相關(guān)報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用該技術(shù)同時(shí)觀察早期DM大鼠耳廓和腎臟微血管血流量及在中藥糖腎安煎劑干預(yù)后的變化，探討中藥改善DM微循環(huán)障礙的有關(guān)機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

SPF級(jí)健康雄性SD大鼠40只，體重200±20g，由北京華阜康生物科技股份有限公司提供，動(dòng)物合格證編號(hào)：SYXK(遼)2013-0009。

1.2 試劑和藥品

鏈脲佐菌素(STZ，批號(hào)：S8050，美國Sigma公司)；胰激肽原酶腸溶片(怡開， 批號(hào)：140517，120U/片，常州千紅生化制藥股份有限公司)；糖腎安煎劑(由黃芪、茯苓、白術(shù)、丹參、黃精、山茱萸等組成)。

1.3 主要儀器

全景激光灌注成像儀(型號(hào)：moor FLPI-2，英國Moor儀器有限公司)；血糖儀及血糖試紙(德國拜耳拜安康系列)。

1.4 實(shí)驗(yàn)方法

1.4.1 動(dòng)物造模與分組:40只大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，按照體重隨機(jī)分為正常對(duì)照組(n=10)，給予普通飼料喂養(yǎng)；余30只高糖高脂飼料 (按豬油10%、蔗糖20%、膽固醇2%、膽酸鹽1%、普通飼料67%配比)喂養(yǎng)4周后禁食12h，一次性左側(cè)腹腔注射小劑量STZ(35mg/kg)，72h后尾靜脈取血測(cè)血糖(BG)，其值≥16.7mmol/L確認(rèn)為造模成功[9](2只未成模，予以剔除)。28只成模大鼠隨機(jī)分為DM模型組(n=9)、西藥治療組(n=9)、中藥治療組(n=10)。對(duì)照組注射等量檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液。

1.4.2 給藥:西藥治療組給予胰激肽原酶腸溶片混懸液(研末溶于生理鹽水中，濃度11.2U/ml)，中藥治療組給予糖腎安煎劑18g生藥/kg/天(根據(jù)成人等效藥量及人與大鼠體表面積換算而得)濃縮成濃度5.4g/ml的煎劑，兩組均按照6.7ml/kg/天灌胃。DM模型組、正常對(duì)照組大鼠給予等量生理鹽水。各組連續(xù)灌胃8周。

1.5 血流量檢測(cè)

藥物干預(yù)8周后，各組大鼠以10%水合氯醛溶液(3ml/kg)腹腔注射麻醉。先背位固定，平展大鼠右側(cè)耳背，將moor FLPI-2散斑血流實(shí)時(shí)成像系統(tǒng)的 CCD 相機(jī)置于垂直耳廓上方20-30cm處，調(diào)節(jié)焦距至圖像顯示清晰；設(shè)定儀器參數(shù)為高分辨率像素(752×580像素)模式，采集速度25幀/s，每秒獲取一幅血流圖，間隔時(shí)間為1s，曝光時(shí)間為20ms，每只大鼠連續(xù)采樣10-20s，逐一存儲(chǔ)。之后，腹部常規(guī)消毒，剖開腹腔，暴露右側(cè)腎臟皮層表面，以同樣方法獲取腎臟血流圖。

采用moor FLPI-2.Review V4.0軟件分析各組散斑血流圖，圖中顏色表示瞬間血流量，大小依次為紅色>黃色>綠色>藍(lán)色。利用軟件輸出監(jiān)測(cè)時(shí)間內(nèi)每張圖片的血流量(LSPU)。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié) 果

2.1 各組大鼠耳廓微循環(huán)血流量

正常對(duì)照組大鼠耳廓血流圖以黃色為主，DM模型組大鼠耳廓血流圖以紅色為主，即灌注量增加；西藥治療組、中藥治療組大鼠耳廓血流圖中紅色減少，黃色、藍(lán)色增多，即灌注量下降。見圖1。

定量分析表明，各組大鼠耳廓微循環(huán)血流量差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=9.529，P<0.01)； 與正常對(duì)照組比較，DM模型組顯著升高(t=-4.019，P<0.01)；與DM模型組比較，西藥治療組、中藥治療組均顯著降價(jià)(t=2.784，t=2.677，P<0.01)；西藥治療組、中藥治療組及正常對(duì)照組之間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=2.655，P>0.05)。見表1。

表1 各組大鼠耳廓血流量比較

注：與正常對(duì)照組比較，1)P<0.01；與DM模型組比較，2)P<0.01

2.2 各組大鼠腎臟微循環(huán)血流量

正常對(duì)照組大鼠腎臟血流圖以黃色為主；DM模型組大鼠腎臟血流圖以紅色為主，灌注量升高；西藥治療組、中藥治療組大鼠腎臟血流圖以黃色為主，灌注量下降。見圖2。

定量分析顯示，各組大鼠腎臟微循環(huán)血流量差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=22.732，P<0.01)； 與正常對(duì)照組比較，DM模型組顯著升高(t=-6.672，P<0.01)；與DM模型組比較，西藥治療組、中藥治療組均顯著降低(t=7.956，t=2.931，P<0.01)；西藥治療組、中藥治療組及正常對(duì)照組之間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=0.906，P>0.05)。見表2。

表2 各組大鼠腎臟血流量比較

注：與正常組比較，1)P<0.01；與模型組比較，2)P<0.01

[本文圖1、圖2見封2]

3 討 論

微循環(huán)障礙包括三個(gè)方面:血流動(dòng)力學(xué)異常、微血管病變和血液流變學(xué)改變。微循環(huán)障礙早期血流動(dòng)力學(xué)異?？沙霈F(xiàn)微血管血流量增加、壓力增高等，屬于微循環(huán)功能異常,一般是可逆性的[10]。因此，除綜合治療外，早期實(shí)施有效改善微循環(huán)策略成為DM微血管病變的治療措施。

已有研究[11]證實(shí),糖腎安煎劑可以有效地降低DM大鼠尿微量白蛋白(mALB)和血、尿轉(zhuǎn)化生長因子β1(TGF-β1)水平，預(yù)防腎纖維化，減輕腎小球病理學(xué)改變。丹參具有降低血黏度、抗凝、抗血栓、促進(jìn)纖溶、改善微循環(huán)等作用，其提取物丹參多酚酸鹽能夠提高DM患者體內(nèi)抗氧化酶超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)等的活性水平[12]；丹參、黃芪及二者合用能夠提高大鼠腎組織線粒體呼吸功能及腎臟組織內(nèi)三磷酸腺苷(ATP)含量，改善DN大鼠的腎臟功能[13]。黃芪中的黃芪甲苷能使BG、mALB降低、腎臟肥大減輕、提高足細(xì)胞黏附分子的表達(dá)[14]，黃芪總皂苷能夠抑制高糖誘導(dǎo)下的大鼠腎小球系膜細(xì)胞的過度增殖，下調(diào)一氧化氮合酶(NOS)表達(dá)，降低NO含量，保護(hù)腎臟[15]。山茱萸環(huán)烯醚萜總苷有明顯降血糖作用，抑制氧化應(yīng)激，對(duì)DN及DM血管并發(fā)癥均有良好保護(hù)作用[16]。

胰激肽原酶屬于絲氨酸蛋白水解酶，是人體激肽釋放系統(tǒng)的重要組成部分，許琳[17]認(rèn)為早期T2DM患者體內(nèi)激肽釋放酶活性受到明顯抑制，難以發(fā)揮激肽系統(tǒng)固有的作用，因而早期、及時(shí)補(bǔ)充激肽釋放酶，對(duì)恢復(fù)激肽系統(tǒng)的活性尤為重要。魏京霞[18]也指出，激肽原酶能夠降解激肽原釋放出激肽作用于微血管，使血管擴(kuò)張，同時(shí)抑制基底膜細(xì)胞增生，防治其增厚，還能激活纖溶系統(tǒng)，抑制血小板聚集，預(yù)防腎毛細(xì)血管微血栓形成，從而部分糾正DM早期的血流動(dòng)力學(xué)異常，改善微循環(huán)。

本文結(jié)果顯示，與正常對(duì)照組比較，DM模型組大鼠耳廓及腎臟血流量顯著升高，經(jīng)西藥和中藥治療8周后，其血流量顯著降低，與正常對(duì)照組水平相近。表明DM大鼠微循環(huán)障礙的早期表現(xiàn)可能為血流量增加，中藥復(fù)方糖腎安煎劑能明顯減輕這種病理變化，其效果與胰激肽原酶相當(dāng)。

本實(shí)驗(yàn)所用LSI技術(shù)直接地檢測(cè)了大鼠耳廓與腎臟微循環(huán)血流，也間接反映了全身微循環(huán)狀況，而且操作簡(jiǎn)便，分辨率高，成像速度快，無需注入造影劑便可得到實(shí)時(shí)的二維速度分布圖，對(duì)判斷病情、 觀察療效和研究循環(huán)系統(tǒng)疾病的發(fā)病機(jī)制等方面可能有積極作用。

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本文第一作者簡(jiǎn)介：

石玉婷(1989—)，女，漢族，碩士研究生，主要從事內(nèi)分泌專業(yè)相關(guān)疾病的研究

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中國人群HCV精確基因分型和新亞型的鑒定

本刊編委，武漢大學(xué)人民醫(yī)院檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)中心童永清等于2015年在《Clinical Microbiology and Infection》( 2區(qū)，IF= 5.768)發(fā)表了題為“Accurate genotyping of hepatitis C virus through nucleotide sequencing and identification of new HCV subtypes in China population”的研究論文，主要內(nèi)容如下：

1 研究背景和目的：丙型肝炎病毒(HCV)非結(jié)構(gòu)蛋白5B(NS5B)區(qū)域核苷酸測(cè)序是HCV基因分型的金標(biāo)準(zhǔn)。本文擬建立一種新的NS5B區(qū)域核苷酸測(cè)序方法，并對(duì)該方法能否增加HCV基因測(cè)序的準(zhǔn)確性和靈敏度進(jìn)行評(píng)估。

2 方法：從HCV數(shù)據(jù)庫中提取HCV基因組序列，采用BLAST分析序列的相似性，利用Primer5.0等引物設(shè)計(jì)軟件設(shè)計(jì)所有可能的PCR擴(kuò)增引物，通過進(jìn)化樹分析所擴(kuò)增片段的分型能力。利用設(shè)計(jì)的引物檢測(cè)HCV感染人群，分析其對(duì)HCV的分型能力。

3 結(jié)果：比對(duì)HCV數(shù)據(jù)庫中1 127株HCV基因組序列，設(shè)計(jì)獲得8對(duì)新引物。通過對(duì)新引物擴(kuò)增DNA序列測(cè)序，發(fā)現(xiàn)其可特異并準(zhǔn)確地測(cè)定5個(gè)標(biāo)準(zhǔn)HCV亞型(1a、2a、3b、6a和1b)。并且這些新引物可從567份臨床標(biāo)本中檢測(cè)出所有HCV亞型，而且靈敏度高。另外，新的引物從這些標(biāo)本中鑒定出3種新的HCV亞型(1b-2a、1b-2k和6d-6k)。

4 結(jié)論：這些新引物擴(kuò)增NS5B區(qū)域的能力優(yōu)于既往設(shè)計(jì)的引物，可以更準(zhǔn)確地鑒定HCV病毒株亞型，有助于臨床診斷、臨床治療指導(dǎo)、臨床患者管理和HCV流行病學(xué)研究。

The Effect of Tang Shenan Decoction on Microcirculation Blood Flow in Auricle and Kidney of Early Diabetic Rats

SHI Yu-ting1， ZHOU Chen-chen1， WANG Mei2，#， YU Shi-jia2

1Graduate Institute of Liaoning University of Traditional Chinese Medicine, Shenyang 110847，China;2Department of Endocrinology, The Affiliated Hospital of Liaoning University of Traditional Chinese Medicine,Shenyang 110032,China;#

Objective:To observe the effect of tang shenan decoction on microcirculation blood flow in early diabetic rat auricle and kidney by using laser speckle imaging (LSI) technology.Method:30 SD rats were choosen to establish the diabetic rats models by high-lipids and high-sucrose diets for 4thweek and then intraperitoneal injection of one-time (STZ,35mg/kg),and then they were randomly divided into DM model group(n=9), western medicine-treated group (n=9)and chinese medicine-treated group(n=10),another 10 SD rats were served as the control group.All groups were given relevant medicinal intragastrically. The changes of rats auricle and kidney microcirculation blood flow were detected by a Moor-full field laster perfusion imager (Moor-FLPI) at the end of 8thweek. Results:The rats aurical and kidney blood flow of DM model were 133.42±49.58LSPU and 297.19.85±39.43LSPU. The control group were 70.04±7.28LSPU and 239.27±33.27LSPU. Both chinese medicine-treated group 77.11±14.16LSPU,253.6±35.57 LSPU and western medicine-treated group 82.71±14.03LSPU,248.96±39.26 LSPU were obviously lower than the DM model group, and the differences were significant(P<0.01),but we found no statistical difference among chinese medicine-treated group、western medicine-treated group and the control group(P>0.05).Conclusion:Tang shenan decoction have the equivalent efficacy with pancreatic kininogenase in reducing the blood flow of rats aurical and kidney which was caused by early-stage diabetic.

Tang shenan decoction； Pancreatic kininogenase enteric-coated tablets；Laser speckle imaging technology；Microcirculatory blood flow；Diabetic rat

沈陽市科技局項(xiàng)目(F14-231-1-11)

1遼寧中醫(yī)藥大學(xué)研究生學(xué)院，沈陽 110847；2遼寧中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院內(nèi)分泌科，沈陽 110032；#

，E-mail：wm896464@163.com

本文2015-05-12收到，2015-06-27修回

R587.2

A

1005-1740(2015)03-0005-04