張曉艷 劉明明 李炳蔚 劉淑英 李宏偉 修瑞娟

觀察鏈脲佐菌素誘導(dǎo)的BALB/c糖尿病小鼠睪丸微循環(huán)損害*

張曉艷 劉明明 李炳蔚 劉淑英 李宏偉 修瑞娟#

目的：觀察鏈脲佐菌素(STZ)誘導(dǎo)的BALB/c糖尿病小鼠睪丸微循環(huán)變化。方法：20只BALB/c小鼠，采用完全隨機(jī)法分為糖尿病組和對(duì)照組，每組10只。糖尿病組小鼠連續(xù)5天腹腔注射40mg/kg STZ誘導(dǎo)糖尿病模型，對(duì)照組注射檸檬酸緩沖液。一周后，應(yīng)用激光多普勒成像系統(tǒng)(Moor LDLS)檢測(cè)兩組小鼠下腹-外陰部皮膚微循環(huán)血流灌注水平；分離腹膜，暴露睪丸，應(yīng)用激光多普勒血流灌注檢測(cè)系統(tǒng)(Moor VMS-LDF)檢測(cè)兩組小鼠睪丸微循環(huán)血流量及睪丸微血管自律運(yùn)動(dòng)。心臟灌流后取兩組小鼠睪丸制作組織切片，HE染色觀察睪丸微血管形態(tài)，免疫組織化學(xué)染色兩步法觀察睪丸微血管內(nèi)皮細(xì)胞抗血小板內(nèi)皮細(xì)胞黏附分子-1(PECAM-1)表達(dá)水平。結(jié)果：糖尿病組小鼠下腹-外陰部皮膚總血流灌注量低于對(duì)照組(P<0.01)；睪丸平均血流灌注水平和微血管自律運(yùn)動(dòng)頻率和振幅均顯著低于對(duì)照組(P<0.01)；糖尿病組小鼠生精上皮受損，成熟生精細(xì)胞減少；睪丸間質(zhì)微血管增多。睪丸間質(zhì)微血管內(nèi)皮細(xì)胞PECAM-1表達(dá)水平低于對(duì)照組(P<0.01)。結(jié)論：STZ誘導(dǎo)的BALB/c糖尿病小鼠睪丸微循環(huán)存在較多損害。

糖尿病小鼠； 睪丸； 微循環(huán)

生育能力降低和不育是男性糖尿病患者常見(jiàn)并發(fā)癥之一[1]。近年研究表明，微循環(huán)功能可能參與了糖尿病及其并發(fā)癥的發(fā)病機(jī)制[2-4]。睪丸微血管內(nèi)皮細(xì)胞及其維系的睪丸微血管自律運(yùn)動(dòng)對(duì)睪丸血流灌注至關(guān)重要，是睪丸生精功能的結(jié)構(gòu)和功能基礎(chǔ)[5]。目前，糖尿病時(shí)睪丸微循環(huán)功能異常與睪丸生殖功能損害的關(guān)系仍未闡明。本研究通過(guò)鏈脲佐菌素(STZ)誘導(dǎo)BALB/c小鼠糖尿病模型，初步觀察其睪丸微循環(huán)和組織病理學(xué)改變，為糖尿病生殖功能損害機(jī)制提供相關(guān)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物、試劑和儀器

實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：SPF級(jí)雄性BALB/c小鼠20只，體質(zhì)量20-25g，購(gòu)自中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究所[SCXK(京)2009-0007]。本研究方案經(jīng)中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院微循環(huán)研究所倫理委員會(huì)審核批準(zhǔn)。

主要試劑及儀器：STZ凍干粉(S0130，Lot No.18883-66-4，美國(guó)Sigma公司，使用時(shí)用檸檬酸緩沖液配成懸液)。山羊抗小鼠血小板內(nèi)皮細(xì)胞黏附分子-1抗體(PECAM-1，sc-1506，Lot No.G0113，美國(guó)Santa Cruz公司)；4%多聚甲醛(P1110，Lot No.20140113，中國(guó)索萊寶公司)，Polink-2 Plus山羊超敏兩步法免疫組化檢測(cè)試劑盒(PV9003，Lot No.K132415A，中國(guó)中杉金橋公司)；檸檬酸(10007118，Lot No.20130704)、檸檬酸三鈉(10019492，Lot No.20130718)均購(gòu)自中國(guó)國(guó)藥集團(tuán)。微量血糖儀及配套血糖試紙(強(qiáng)生穩(wěn)豪型，Lot No.3623898，美國(guó)強(qiáng)生公司)；激光多普勒掃描成像系統(tǒng)(Moor LDLS)和激光多普勒血流灌注監(jiān)測(cè)系統(tǒng)(Moor VMS-LDF)均為英國(guó)Moor公司產(chǎn)品。

1.2 動(dòng)物分組處理

BALB/c小鼠飼養(yǎng)于室溫22-25℃、空氣濕度50%左右、12h明暗交替環(huán)境，自由飲水進(jìn)食。適應(yīng)性喂養(yǎng)一周后，稱取基線體質(zhì)量，并測(cè)定空腹血糖。采用完全隨機(jī)法分為對(duì)照組(n=10)和糖尿病組(n=10)。糖尿病組小鼠造模前禁食6h，連續(xù)5天腹腔注射STZ(40mg/kg)，一周后，采尾靜脈血檢測(cè)其空腹血糖值，大于16.7mmol/L為成模[6]。對(duì)照組連續(xù)5天腹腔注射等量檸檬酸緩沖液。

1.3 局部皮膚微循環(huán)血流灌注量檢測(cè)

采用Moor LDLS檢測(cè)兩組小鼠下腹-外陰部皮膚微循環(huán)血流灌注水平。1.5%戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉小鼠后，將其腹部向上固定于掃描臺(tái)，分別應(yīng)用單幅、連續(xù)重復(fù)圖像掃描、單線及多通道進(jìn)行數(shù)據(jù)采集。掃描分辨率及掃描速度100ms/line，掃描視距12cm。連續(xù)重復(fù)掃描間隔時(shí)間5s，采樣顯示頻率5Hz。掃描寬度64像素，輪廓50像素，單次掃描時(shí)間1min，時(shí)程3min。設(shè)定小鼠下腹-外陰局部皮膚為興趣區(qū)域(ROI)，測(cè)量其總血流灌注量(PU)。

1.4 睪丸微循環(huán)血流灌注水平和微血管自律運(yùn)動(dòng)檢測(cè)

十字切口切開(kāi)小鼠近會(huì)陰部皮膚，分離腹膜，提拉附著于附睪的白色脂肪以暴露小鼠睪丸。應(yīng)用Moor VMS-LDF(VP4針式探針)檢測(cè)小鼠睪丸微循環(huán)血流量及睪丸微血管自律運(yùn)動(dòng)。LDF監(jiān)測(cè)基帶帶寬15kHz，血流量輸出5V=1 000Units，時(shí)間常數(shù)0.5s。單次掃描時(shí)間1min，時(shí)程3min。通過(guò)Moor VMS PC 2.1軟件提取各時(shí)相的睪丸血流灌注水平(PU)，計(jì)算平均灌注量(PU/min)，通過(guò)單位時(shí)間內(nèi)多普勒血流圖波峰或波谷頻數(shù)計(jì)算睪丸微血管自律運(yùn)動(dòng)頻率(cycles/min)，通過(guò)單位時(shí)間內(nèi)多普勒血流圖波峰與波谷血流灌注單位差值計(jì)算睪丸微血管自律運(yùn)動(dòng)振幅(△PU)。

1.5 心臟灌流取材

微循環(huán)活體測(cè)量完成后行心臟灌流取材。小鼠胸部縱形皮膚切開(kāi)，于左側(cè)肋骨與胸骨交界處開(kāi)胸，打開(kāi)心包，暴露心臟；7號(hào)鈍頭空心針經(jīng)左心室插管至主動(dòng)脈，動(dòng)脈夾固定鈍頭針。剪開(kāi)右心耳，注入37℃肝素化生理鹽水(4 000U/L)，起始灌流速度0.015L/min，4min后以0.01L/min再灌5min，至流出液透明無(wú)血色為止。分離附睪及脂肪，將睪丸置于4%多聚甲醛固定液中。

1.6 組織切片HE染色

取出固定后睪丸組織進(jìn)行常規(guī)梯度酒精脫水、透明、石蠟包埋，切片(5μm)和HE染色。光鏡下觀察睪丸生精小管及間質(zhì)微血管形態(tài)結(jié)構(gòu)的改變。

1.7 免疫組織化學(xué)染色

采用兩步法檢測(cè)PECAM-1在睪丸微血管內(nèi)皮細(xì)胞中的表達(dá)。采用常規(guī)方法對(duì)石蠟切片進(jìn)行脫蠟、水化、蒸餾水沖洗后，用3% H2O2孵育10min去除內(nèi)源性過(guò)氧化物酶，3%牛血清白蛋白室溫封閉30min，按1∶50加入山羊抗小鼠PECAM-1抗體，4℃過(guò)夜，磷酸鹽緩沖液(PBS)清洗3次，每次5min；滴加高分子聚合物輔助劑Polymer Helper，室溫孵育20min，PBS清洗3次；滴加辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的抗山羊二抗(poly-HRP anti goat IgG)，室溫孵育20min，PBS清洗3次；DAB溶液顯色，自來(lái)水充分沖洗、蘇木素復(fù)染細(xì)胞核；蒸餾水浸泡3min，梯度酒精脫水，二甲苯透明，中性樹(shù)膠封片后鏡檢。應(yīng)用Image J(1.48v)進(jìn)行PECAM-1表達(dá)水平的比較，選擇兩組小鼠睪丸微血管內(nèi)皮細(xì)胞陽(yáng)性表達(dá)區(qū)域(棕色)進(jìn)行積分光密度(IOD)的定量分析。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié) 果

2.1 實(shí)驗(yàn)小鼠成模情況

糖尿病組10只小鼠腹腔注射STZ一周后空腹血糖均超過(guò)16.7mmol/L(19.80±2.06mmol/L)，并表現(xiàn)出多飲、多尿、多食及體重降低等糖尿病典型臨床表現(xiàn)，全部成模。對(duì)照組小鼠血糖水平未見(jiàn)異常(5.62±0.59mmol/L)。

2.2 兩組小鼠下腹-外陰部血流灌注量

與對(duì)照組小鼠相比，糖尿病組小鼠下腹-外陰部局部皮膚總血流灌注量明顯降低(2 300.08±327.09PU vs 1 308.34±303.70PU，t=7.027，P<0.01)。

2.3 兩組小鼠睪丸血流灌注水平及睪丸微血管自律運(yùn)動(dòng)

對(duì)照組小鼠睪丸血流灌注連續(xù)穩(wěn)定，糖尿病組小鼠失去正常節(jié)律。與對(duì)照組比較，糖尿病組平均血流灌注量顯著降低(466.20±15.00PU/min vs 113.50±18.60PU/min，t=46.670,P<0.01)、睪丸微血管自律運(yùn)動(dòng)頻率降低(89.30±3.50cycles/min vs 30.70±3.50cycles/min，t=20.460，P<0.01)、自律運(yùn)動(dòng)振幅亦降低(364.50±43.10ΔPU vs 69.10 ± 22.80ΔPU，t=10.500，P<0.01)。見(jiàn)圖1。

2.4 兩組小鼠睪丸組織形態(tài)觀察

對(duì)照組小鼠生精上皮細(xì)胞完整，各級(jí)生精細(xì)胞有序排列，并可見(jiàn)成熟生精細(xì)胞及長(zhǎng)形精子，睪丸間質(zhì)可見(jiàn)微血管分布。糖尿病組小鼠睪丸間質(zhì)疏松，微血管及間質(zhì)細(xì)胞數(shù)量增多；生精小管直徑縮小，曲細(xì)精管內(nèi)生精上皮受損，表現(xiàn)為生精上皮變薄甚至呈空泡樣改變，細(xì)胞殘?bào)w增多，生精細(xì)胞退化， 排列紊亂，成熟生精細(xì)胞減少。見(jiàn)圖2。

圖1 兩組小鼠睪丸血流灌注圖

2.5 兩組小鼠睪丸PECAM-1表達(dá)水平

對(duì)照組小鼠睪丸間質(zhì)血管內(nèi)皮細(xì)胞PECAM-1連續(xù)完整(IOD=106.60±6.90)；糖尿病組小鼠睪丸間質(zhì)內(nèi)皮細(xì)胞PECAM-1表達(dá)缺乏連續(xù)性，PECAM-1表達(dá)水平(IOD=49.40±6.00)顯著低于對(duì)照組小鼠(t=12.525，P<0.01)。見(jiàn)圖3。

[本文圖2、圖3見(jiàn)封2]

3 討 論

隨著糖尿病發(fā)病年齡的年輕化，糖尿病對(duì)生殖功能的影響逐漸受到關(guān)注。有文獻(xiàn)報(bào)道糖尿病初期睪丸細(xì)胞抗氧化能力顯著下降，能量、物質(zhì)代謝水平異常[7]；糖尿病患者睪丸細(xì)胞功能障礙，可能與持續(xù)高血糖導(dǎo)致的氧化應(yīng)激、活性氧生成增多有關(guān)[8-10]；高血糖可破壞Sertoli細(xì)胞/血-睪屏障功能，損傷精子質(zhì)量和生育能力[11]。睪丸微血管內(nèi)持續(xù)而穩(wěn)定的血流灌注對(duì)維持睪丸細(xì)胞正常生精功能及內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定起著極為重要的作用[12]。因此，睪丸微循環(huán)損害可能參與了糖尿病時(shí)睪丸細(xì)胞的病理改變。

機(jī)體微血管(包括睪丸微血管)自律運(yùn)動(dòng)指微血管自主收縮和舒張，其節(jié)律沿微血管管壁呈波浪式傳播，從而控制血液呈單向連續(xù)流動(dòng)[13]，調(diào)節(jié)微循環(huán)血流灌注量及其再分布[14]，是評(píng)價(jià)機(jī)體微循環(huán)和睪丸微循環(huán)功能狀態(tài)的重要指標(biāo)。本研究中糖尿病小鼠睪丸血流灌注水平降低，睪丸微血管自律運(yùn)動(dòng)失去正常頻率和振幅可能影響睪丸微循環(huán)血液灌注的有效分配，以及血液與組織間激素[15]、營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的運(yùn)輸和代謝產(chǎn)物的交換，是睪丸細(xì)胞生殖功能異常的原因之一。

睪丸微血管內(nèi)皮細(xì)胞是睪丸微循環(huán)的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)[16]，其結(jié)構(gòu)及功能的完整是保證睪丸微血管內(nèi)血液穩(wěn)定灌注的必要條件。高糖毒性可能造成睪丸微血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷，間接影響精子的發(fā)生。本研究證實(shí)糖尿病小鼠睪丸生精細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)異常，成熟生精細(xì)胞減少。為探討原因，筆者檢測(cè)了對(duì)維持微血管內(nèi)皮細(xì)胞完整性至關(guān)重要的PECAM-1。結(jié)果表明，糖尿病小鼠睪丸微血管內(nèi)皮細(xì)胞PECAM-1表達(dá)顯著減少，并失去連續(xù)性，甚至表達(dá)缺失。進(jìn)一步提示糖尿病造成了睪丸微血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷以及睪丸生精功能受損。此外，有文獻(xiàn)報(bào)道，糖尿病還引起睪丸微動(dòng)脈管壁增厚，管徑變小，從而加重缺氧誘導(dǎo)的睪丸細(xì)胞損傷，影響精子產(chǎn)生，造成男性不育[17, 18]。

綜上所述，糖尿病時(shí)睪丸微血管內(nèi)皮細(xì)胞功能損害及睪丸微循環(huán)自律運(yùn)動(dòng)異?？赡苁翘悄虿?dǎo)致睪丸生殖功能受損的機(jī)制之一。改善睪丸微循環(huán)及睪丸微血管自律運(yùn)動(dòng)可能是臨床治療男性糖尿病患者生精功能障礙的新靶點(diǎn)。

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本文第一作者簡(jiǎn)介：

張曉艷(1967-)，女，漢族，博士，助理研究員，研究方向?yàn)椴G丸微循環(huán)

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Impairment of Testicular Microcirculation in STZ induced BALB/c Diabetic Mice

ZHANG Xiao-yan, LIU Ming-ming, LI Bing-wei, LIU Shu-ying, LI Hong-wei, XIU Rui-juan#

Institute of Microcirculation, Key Laboratory of Microcirculation, Ministry of Health, CAMS & PUMC, Beijing 100005, China;#Corresponding author

Objective:To investigate changes of testicular microcirculation in STZ induced BALB/c diabetic mice. Method:20 BALB/c mice were randomly divided into diabetic group (n=10) and control group (n=10). Diabetic mice were treated with 40 mg/kg STZ for 5 consecutive days while control group was injected with citric acid buffer intraperitoneally. After one week, blood perfusion of lower abdominal - genital skin was evaluated by Moor LDLS, while testicular blood perfusion and microvascular vasomotion were detected by Moor VMS LDF after exposing. Followed cardiac perfusion, the testis of two group mice were prepared. HE staining was used to observe morphological and pathological of testicular micro-vessels, immunohistochemistry staining was employed to determine the expression of PECAM-1. Results:Compared with control group, diabetic mice had decreased lower abdominal - genital skin total blood perfusion (P<0.01), decreased average blood perfusion, frequency and amplitude of vasomotion of testicular micro-vessels (P<0.01, respectively), damaged seminiferous epithelium, decreased matured spermatid, increased interstitial testicular capillaries and discontinuous expression of PECAM-1 (P<0.01). Conclusion:Testicular microcirculation impairs in STZ induced BALB/c diabetic mice.

Diabetic mice; Testis; Microcirculation

中央高?；究蒲袠I(yè)務(wù)費(fèi)專項(xiàng)資金資助(33320140193)

中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院、北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院微循環(huán)研究所；衛(wèi)生部微循環(huán)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京100005；#

，E-mail:xiurj@imc.pumc.edu.cn

本文2015-01-30收到，2015-05-13修回

R587.1

A

1005-1740(2015)03-0001-04