姚啟楊，潘婷婷，許戈良，李建生，馬金良，莢衛(wèi)東，余繼海，葛勇勝，劉文斌，任維華

缺氧誘導(dǎo)因子2α在肝癌中的表達(dá)及其與血管生成、上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化的關(guān)系

姚啟楊1，潘婷婷2，許戈良1，李建生1，馬金良1，莢衛(wèi)東1，余繼海1，葛勇勝1，劉文斌1，任維華1

摘要目的 研究缺氧誘導(dǎo)因子2α（HIF-2α）在肝細(xì)胞肝癌中的表達(dá)情況及其與血管生成和上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）的關(guān)系。方法 收集正常肝組織15例、肝癌組織和相應(yīng)的癌旁組織各63例，采用免疫組化染色法檢測HIF-2α的表達(dá)，分析其表達(dá)與肝癌臨床病理特征及生存預(yù)后之間的關(guān)系；同時(shí)分析肝癌組織中HIF-2α、白細(xì)胞分化抗原34（CD34）、波形蛋白（Vimentin）的表達(dá)，探究HIF-2α的表達(dá)與血管生成、EMT的關(guān)系。結(jié)果 免疫組化染色法顯示HIF-2α在肝癌組織中主要在胞質(zhì)表達(dá)，顯著高于癌旁組織及正常肝組織（P＜0.001）。HIF-2α的表達(dá)與腫瘤最大徑、腫瘤TNM分期、Edmondson分級及包膜和血管侵犯有關(guān)，與患者年齡、性別、乙肝表面抗原表達(dá)、甲胎蛋白（AFP）、Child-Pugh分級、腫瘤結(jié)節(jié)數(shù)目及腫瘤內(nèi)壞死無關(guān)。相關(guān)性分析顯示HIF-2α的表達(dá)與微血管密度（MVD）有關(guān)（t＝5.919，P＜0.001），與Vimentin的表達(dá)無關(guān)（r＝1.013，P＝0.209）。生存分析顯示，高表達(dá)組術(shù)后總體生存率明顯低于低表達(dá)組（P＜0.001）。多因素分析顯示瘤內(nèi)壞死、腫瘤血管侵襲和HIF-2α表達(dá)是影響肝癌患者總生存率的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。結(jié)論HIF-2α可促進(jìn)肝癌血管生成，但可能不參與EMT，可作為判斷肝癌患者預(yù)后的指標(biāo)之一。

關(guān)鍵詞肝癌；缺氧誘導(dǎo)因子2α；血管生成，病理性；因素分析，統(tǒng)計(jì)學(xué)

2015－01－22接收

作者單位：1安徽醫(yī)科大學(xué)附屬省立醫(yī)院普通外科、肝膽胰外科安徽省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，合肥 230001

2天津醫(yī)科大學(xué)附屬研究生學(xué)院，天津 300070

缺氧誘導(dǎo)因子2α（hypoxia inducible factor-2α，HIF-2α）也稱為內(nèi)皮PAS區(qū)域蛋白1，在多種腫瘤中發(fā)現(xiàn)其參與能量代謝、血管生長、侵襲轉(zhuǎn)移等過程，在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中起著重要的作用［1］。該實(shí)驗(yàn)采用免疫組化SP法檢驗(yàn)HIF-2α的表達(dá)是否對肝細(xì)胞肝癌的血管生成和上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化（epithelial-mesenchymal transition，EMT）產(chǎn)生影響，探討HIF-2α與肝癌的發(fā)生發(fā)展及預(yù)后的關(guān)系。

1 材料與方法

1．1 病例資料 收集2008年10月～2012年7月于安徽醫(yī)科大學(xué)附屬省立醫(yī)院行根治性手術(shù)切除且術(shù)后病理證實(shí)為肝細(xì)胞性肝癌患者的組織標(biāo)本，肝癌組織和對應(yīng)的癌旁組織各63例；其中男50例，女性13例，年齡31～74（54.9±11.5）歲?；颊咝g(shù)前均未接受過介入、化療等抗腫瘤治療，術(shù)后未出現(xiàn)如大出血、膽漏、肝功能衰竭等嚴(yán)重并發(fā)癥。其中Edmondson分級Ⅰ級14例，Ⅱ級34例，Ⅲ-Ⅳ級15例；臨床TNM分期Ⅰ-Ⅱ期25例，Ⅲ-Ⅳ期38例。另取15例非腫瘤原因行肝部分切除術(shù)的肝臟組織作為對照，鏡下證實(shí)為正常肝組織。

1．2 試劑 鼠抗人HIF-2α抗體購自美國Abcam公司；鼠抗白細(xì)胞分化抗原34（CD34）、波形蛋白（Vimentin）抗體、辣根過氧化物酶標(biāo)記的通用型二抗和DAB顯色試劑盒購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。

1．3 免疫組化染色法 標(biāo)本常規(guī)行石蠟切片，切片厚度4 μm；每張切片先行HE染色，再按照試劑盒說明書進(jìn)行SP法染色。陰性對照以PBS液代替一抗。結(jié)果判定：Vimentin和HIF-2α蛋白以細(xì)胞質(zhì)中出現(xiàn)黃色顆粒視為陽性表達(dá)。染色判定采用半定量計(jì)數(shù)法，即低倍鏡（10×10）視野下檢測染色強(qiáng)度（0 ～3分依次為無、弱、中、強(qiáng)），高倍鏡（40×10）下隨機(jī)選取10處視野根據(jù)肝癌陽性細(xì)胞比例即＜5%、5%～25%、26%～50%、＞50%依次評為0、1、2、3分；將兩項(xiàng)得分相乘即為最后得分，＜4分為低表達(dá)，≥4為高表達(dá)；將HIF-2α染色判定得分＜4分者納入HIF-2α低表達(dá)組，≥4分者納入HIF-2α高表達(dá)組。CD34染色以血管內(nèi)皮細(xì)胞的細(xì)胞膜或細(xì)胞質(zhì)出現(xiàn)棕黃色或棕褐色為陽性，以腫瘤內(nèi)微血管密度（micro vessel density，MVD）的大小來判斷新生血管表達(dá)情況［2］：低倍鏡（10×10）下選擇血管分布最密區(qū)，高倍鏡（10×20）下選取5個(gè)視野計(jì)數(shù)染色的血管數(shù)目，計(jì)算平均值即為MVD，其中血管直徑較大或血管壁厚者不計(jì)數(shù)。

1．4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 16．0軟件進(jìn)行分析。

率的比較采用χ2檢驗(yàn)和Person相關(guān)性分析，均數(shù)的比較采用t檢驗(yàn)。累積生存率采用Kaplan-Meier法，單因素分析預(yù)后采用Log-rank檢驗(yàn)，多因素分析采用Cox回歸模型，比較相對危險(xiǎn)度（relative risk，RR）和95%CI。

2 結(jié)果

2．1 肝癌組織、癌旁組織及正常肝組織中HIF-2α的表達(dá) 免疫組化染色法顯示HIF-2α主要在肝癌細(xì)胞的胞質(zhì)中表達(dá)。見圖1。在肝癌組織中高表達(dá)率為74.6%（47／63），顯著高于癌旁組織（30.2%，19／63）及正常肝組織（13.3%，2／15）（χ2＝24.945、19.473，P＜0.001）。HIF-2α的高表達(dá)與肝癌患者臨床病理特征分析發(fā)現(xiàn)，HIF-2α的高表達(dá)與腫瘤最大徑（χ2＝4.826，P＝0.028）、TNM分期（χ2＝4.665，P＝0.031）、Edmondson分級（χ2＝6.537，P ＝0.038），包膜侵犯（χ2＝6.932，P＝0.008）及血管侵犯（χ2＝4.701，P＝0.030）有關(guān)，而與患者年齡、性別、乙肝表面抗原表達(dá)、甲胎蛋白（a-fetopretein，AFP）、Child-Pugh分級、腫瘤結(jié)節(jié)數(shù)目及腫瘤內(nèi)壞死無關(guān)。見表1。

表1　HIF-2α的表達(dá)與肝癌臨床病理特征的相關(guān)性

2．2 肝癌組織中HIF-2α表達(dá)與CD34、Vimentin的表達(dá)的相關(guān)性 CD34主要在腫瘤血管內(nèi)皮細(xì)胞中表達(dá)。見圖1。免疫組化染色法顯示，HIF-2α高表達(dá)組的肝癌組織中MVD（60.850±20.381）明顯高于低表達(dá)組的MVD（35.240±18.598），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t＝5.919，P＜0.001），說明腫瘤壞死周邊HIF-2α高表達(dá)。Vimentin主要在肝癌細(xì)胞的胞質(zhì)中表達(dá)，呈棕黃色顆粒，其在肝癌組織中高表達(dá)率69.8%（44／63），HIF-2α的表達(dá)與Vimentin的表達(dá)無相關(guān)性（r＝1.013，P＝0.209）。見圖1。

2．3 HIF-2α表達(dá)與患者總體生存率的關(guān)系 入組病例均有完整的隨訪資料，隨訪時(shí)間2～62個(gè)月，中位隨訪時(shí)間為21.2個(gè)月。HIF-2α高表達(dá)組1年、3年累積生存率分別為53.2%和10.6%，相對低表達(dá)組為87.5%和37.5%。Log-rank檢驗(yàn)分析表明HIF-2α高表達(dá)組比低表達(dá)組預(yù)后更差（χ2＝15.686，P＜0.001），見圖2。Cox回歸模型顯示TNM分期、包膜侵犯、腫瘤最大徑及病理分級不是影響患者術(shù)后總體生存率的獨(dú)立因素；瘤內(nèi)壞死（RR＝1.851，95%CI：1.168～2.933，P＝0.009）、腫瘤血管侵襲（RR＝1.929，95%CI：1.173～3.171，P ＝0.010）和HIF-2α表達(dá)（RR＝3.964，95%CI：2.235～7.028，P＜0.001）是影響肝癌患者總生存率的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。見表2。

表2　多因素分析影響肝細(xì)胞肝癌患者預(yù)后的因素（Cox回歸模型）

3 討論

肝癌是常見的惡性腫瘤之一，在常見惡性腫瘤發(fā)生率中位居第五位，其發(fā)生率在逐年上升［3］。目前認(rèn)為外科手術(shù)切除是治療肝癌的首選和最有效的方法，但遠(yuǎn)期療效不佳，術(shù)后5年生存率僅為34.8%［4］。腫瘤的侵襲轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)是影響肝癌患者生存的主要因素，探究肝癌發(fā)生發(fā)展的分子機(jī)制對改善患者預(yù)后和提高患者生存率有十分重要的意義。

HIF-2α是bHLH-PAS超家族成員之一，可介導(dǎo)調(diào)節(jié)下游多種基因，進(jìn)而促進(jìn)腫瘤血管生成、抑制腫瘤細(xì)胞的凋亡、促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖、參與EMT過程及調(diào)節(jié)腫瘤干細(xì)胞生物學(xué)特性［5］。在結(jié)腸癌、乳腺癌、膀胱癌、肺癌、惡性膠質(zhì)瘤等［6］多種腫瘤組織中發(fā)現(xiàn)HIF-2α的表達(dá)顯著升高，但其在肝癌組織的表達(dá)國內(nèi)外研究不一，Yang et al［7］認(rèn)為HIF-2α的高表達(dá)是肝癌預(yù)后不良的一個(gè)獨(dú)立危險(xiǎn)因素，但與臨床病理關(guān)系并不密切；Sun et al［8］認(rèn)為HIF-2α的高表達(dá)有抑制肝癌生長的作用。因此需要多中心、多樣本的研究來排除實(shí)驗(yàn)的假陽性和假陰性。

本實(shí)驗(yàn)免疫組化染色法顯示HIF-2α在肝癌中表達(dá)明顯高于癌旁組織和正常組織。臨床病理分析顯示HIF-2α高表達(dá)和腫瘤的增殖、侵襲轉(zhuǎn)移有關(guān)，與研究［9］結(jié)果相似。HIF-2α在肝癌組織中表達(dá)上調(diào)可能與肝癌組織慢性缺血低氧及抑癌基因VHL的失活有關(guān)。

相關(guān)性研究表明肝癌組織中HIF-2α的表達(dá)與MVD相關(guān)，提示HIF-2α的表達(dá)與肝癌新血管的生成呈正相關(guān)性。新生血管的生成過程包括細(xì)胞外基質(zhì)降解，內(nèi)皮細(xì)胞遷移、增殖和管腔形成，而新生血管生成不僅僅與腫瘤供氧有關(guān)，與腫瘤的侵襲轉(zhuǎn)移也密切相關(guān)。目前認(rèn)為HIF-2α促腫瘤血管生成可能機(jī)制包括［10-13］：①調(diào)控血管內(nèi)皮生成因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）的表達(dá)，同時(shí)可增強(qiáng)內(nèi)皮細(xì)胞中VEGF受體轉(zhuǎn)錄，促進(jìn)VEGF與受體結(jié)合，參與血管的生成；②調(diào)控VEGF外的血管生成因子的表達(dá)，如IL-8和CD82，前者參與腫瘤的血管生成及腫瘤生長轉(zhuǎn)移，后者可降低腫瘤細(xì)胞的運(yùn)動(dòng)活性，增加內(nèi)皮細(xì)胞遷徙能力促進(jìn)血管生成；此外HIF-2α可調(diào)控低氧誘導(dǎo)促有絲分裂因子表達(dá)，后者本身除了有強(qiáng)縮血管作用外，還可促進(jìn)血管生成和血管增生；③調(diào)控VEGF受體外的血管生成因子受體的表達(dá)如促進(jìn)血管生成素受體2的表達(dá)。

EMT過程在肝癌的轉(zhuǎn)移過程中有重要的作用，低氧環(huán)境可誘導(dǎo)肝癌發(fā)生EMT過程，體外實(shí)驗(yàn)［6，14］表明HIF-2α可調(diào)控Snail、twist、Nanog、Oct3／4等基因進(jìn)而參與EMT過程，但本實(shí)驗(yàn)顯示在肝癌中HIF-2α的表達(dá)與Vimentin的表達(dá)并無相關(guān)性，提示在肝癌中HIF-2α的表達(dá)與EMT過程之間的關(guān)系并不顯著，可能由于EMT本身是腫瘤發(fā)展的一個(gè)瞬時(shí)過程，而免疫組化染色也是一種“快照”技術(shù)，有捕捉不到的可能性，因此進(jìn)一步的研究是必要的。

此外，生存分析顯示低表達(dá)HIF-2α的患者術(shù)后累積生存率明顯優(yōu)于高表達(dá)的患者，多因素分析顯

示HIF-2α高表達(dá)是影響肝癌術(shù)后生存的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。綜上所述，HIF-2α蛋白表達(dá)在肝癌組織和正常肝組織中差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，HIF-2α與肝癌促血管生成和侵襲轉(zhuǎn)移的發(fā)生有關(guān)，同時(shí)HIF-2α可作為判斷肝癌患者預(yù)后的有效生物學(xué)指標(biāo)，可能為肝癌的治療提供新的有潛力的靶點(diǎn)。

參考文獻(xiàn)

［1］ Tian H，McKnight S L，Russell D W．Endothelial PAS domain protein 1（EPAS1），a transcription factor selectively expressed in endothelial cells［J］．Genes Dev，1997，11（1）：72－82．

［2］ Weidner N，Semple J P，Welch W R，et al．Tumor angiogenesis and metastasis-correlation in invasive breast carcinoma［J］．N Engl J Med，1991，324（1）：1－8．

［3］ Güthle M，Dollinger M M．Radiologe［J］．Radiologe，2014，54（7）：654－9．

［4］ Fan S T，Mau Lo C，Poon R T，et al．Continuous improvement of survival outcomes of resection of hepatocellular carcinoma：a 20-year experience［J］．Ann Surg，2011，253（4）：745－58．

［5］ Li Z，Bao S，Wu Q，et al．Hypoxia-inducible factors regulate tumorigenic capacity of glioma stem cells［J］．Cancer Cell，2009，15 （6）：501－13．

［6］ Keith B，Johnson R S，Simon M C．HIF1α and HIF2α：sibling rivalry in hypoxic tumour growth and progression［J］．Nat Rev Cancer，2011，12（1）：9－22．

［7］ Yang S L，Liu L P，Jiang J X，et al．The correlation of expression levels of HIF-1α and HIF-2α in hepatocellular carcinoma with capsular invasion，portal vein tumor thrombi and patients′clinical outcome［J］．Jpn J Clin Oncol，2014，44（2）：159－67．

［8］ Sun H X，Xu Y，Yang X R，et al．Hypoxia inducible factor 2 alpha inhibits hepatocellular carcinoma growth through the transcription factor dimerization partner 3／E2F transcription factor 1-dependent apoptotic pathway［J］．Hepatology，2013，57（3）：1088－97．

［9］ Bangoura G，Liu Z S，Qian Q，et al．Prognostic significance of HIF-2alpha／EPAS1 expression in hepatocellular carcinoma［J］．World J Gastroenterol，2007，13（23）：3176－82．

［10］Ku J H，Park Y H，Myung J K，et al．Expression of hypoxia inducible factor-1α and 2α in conventional renal cell carcinoma with or without sarcomatoid differentiation［J］．Urol Oncol，2011，29（6）：731－7．

［11］Florczyk U，Czauderna S，Stachurska A，et al．Opposite effects of HIF-1α and HIF-2α on the regulation of IL-8 expression in endothelial cells［J］．Free Radic Biol Med，2011，51（10）：1882－92．

［12］Nagao K，Oka K．HIF-2 directly activates CD82 gene expression in endothelial cells［J］．Biochem Biophys Res Commun，2011，407 （1）：260－5．

［13］Liang Y，Li X Y，Rebar E J，et al．Activation of vascular endothelial growth factor A transcription in tumorigenic glioblastoma cell lines by an enhancer with cell type-specific DNase I accessibility ［J］．J Biol Chem，2002，277（22）：20087－94．

［14］Mathieu J，Zhang Z，Zhou W，et al．HIF induces human embryonic stem cell markers in cancer cells［J］．Cancer Res，2011，71（13）：4640－52．

Expression of hypoxia-inducible factor-2α in hepatocellular carcinoma and its relationship with epithelial-mesenchymal transition and angiogenesis

Yao Qiyang1，Pan Tingting2，Xu Geliang1，et al
（1Anhui Province Key Laboratory of Hepatopancreatobiliary Surgery，Dept of Hepatic Surgery，Anhui Provincial Hospital，Hefei 230001；2Graduate School of Tianjin Medical University，Tianjing 300070）

AbstractObjective To explore the expression of hypoxia-inducible factor-2α（HIF-2α）in hepatocellular carcinoma and the relationship with epithelial-mesenchymal transition（EMT）and angiogenesis．Methods The expressions of HIF-2α in 63 cases of hepatocellular carcinoma tumor tissues and 15 normal liver tissues were examined by immunohistochemistry．To assess the relationship between the expressions of HIF-2α，EMT and angiogenesis，the expressions of CD34 and Vimentin were detected in hepatocellular carcinoma．Results Immunohistochemistry showed that HIF-2α mainly expressed in the cytoplasm，the rate of HIF-2α overexpression in hepatocellular carcinoma tissues was significantly higher than the other two groups（P＜0.001）．The expression of HIF-2α was correlated with tumor size，TNM stages，Edmondson grade，capsule or vascular invasion．HIF-2α expression had a significantly positive correlation with microvascular density（t＝5.919，P＜0.001），but not vimentin（r＝1.013，P＝0.209）．Survival analysis showed that the prognosis was poor in patients with HIF-2α overexpression（P＜0.001）．Cox regression demonstrated that the expression of HIF-2α，tumor necrosis and vascular invasion were the independent risk factors for cumulative survival in hepatocellular carcinoma patients．Conclusion HIF-2α can promote angiogenesis，but may not participate in EMT．It may be a potential tumor marker for prognosis of hepatocellular carcinoma．

Key wordscarcinoma，hepatocellular；HIF-2α；angiogenesis，pathologic；factor analysis，statistical

作者簡介：姚啟楊，男，碩士研究生；許戈良，男，教授，主任醫(yī)師，博士生導(dǎo)師，責(zé)任作者，E-mail：xugeliang2007＠163．com

基金項(xiàng)目：安徽省科技計(jì)劃項(xiàng)目（編號：1106c0805028）

文獻(xiàn)標(biāo)志碼A

文章編號1000－1492（2015）04－0491－04

中圖分類號R 735．7