袁東紅　王　芳　陳雪梅

作者單位：716000 陜西省延安大學(xué)附屬醫(yī)院(袁東紅，王　芳)；638001 四川省廣安市人民醫(yī)院(陳雪梅)

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食管鱗癌外周血循環(huán)腫瘤細(xì)胞檢測及其臨床意義

袁東紅王芳陳雪梅

作者單位：716000 陜西省延安大學(xué)附屬醫(yī)院(袁東紅，王芳)；638001 四川省廣安市人民醫(yī)院(陳雪梅)

【摘要】目的 探討食管鱗癌患者外周血循環(huán)腫瘤細(xì)胞數(shù)量與食管癌病理生理特征之間的相關(guān)性。方法采用負(fù)性篩選策略，用紅細(xì)胞裂解液和Mitenyi免疫磁珠分步分別去除食管鱗癌患者外周血樣本中紅細(xì)胞和白細(xì)胞，富集上皮來源的稀有細(xì)胞，免疫熒光染色法鑒定循環(huán)腫瘤細(xì)胞。分析術(shù)前循環(huán)腫瘤細(xì)胞檢出陽性水平與臨床各病理生理參數(shù)的相關(guān)性。結(jié)果食管鱗癌患者外周血循環(huán)腫瘤細(xì)胞的檢出陽性水平與患者腫瘤細(xì)胞分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移狀態(tài)(N分期)、p-TNM分期、原發(fā)性腫瘤侵犯程度(T分期)顯著相關(guān)(P<0.05)；與患者的年齡、腫瘤位置無密切相關(guān)(P>0.05)。結(jié)論食管鱗癌患者外周血循環(huán)腫瘤細(xì)胞的檢出數(shù)量可以反映腫瘤的生物學(xué)惡化程度，可作為臨床治療及預(yù)后判斷的重要參考指標(biāo)。

【關(guān)鍵詞】食管鱗癌；循環(huán)腫瘤細(xì)胞；負(fù)性篩選

(ThePracticalJournalofCancer，2015，30：494～496)

食管癌(carcinoma of esophagus)是一種常見消化道惡性腫瘤疾病，發(fā)病率較高，其中鱗狀細(xì)胞癌是主要的病理類型。該病以手術(shù)治療為主，5年生存率只有30%左右，預(yù)后較差，究其原因主要是腫瘤的轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)[1]。血液中的循環(huán)腫瘤細(xì)胞(circulating tumor cells，CTCs)是食管癌術(shù)后復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移、影響預(yù)后的首要條件，因此，檢測循環(huán)腫瘤細(xì)胞對(duì)早期發(fā)現(xiàn)腫瘤的微轉(zhuǎn)移、判斷食管癌的術(shù)后復(fù)發(fā)、評(píng)估療效及指導(dǎo)臨床治療具有重要意義[2]。本研究采用基于細(xì)胞學(xué)水平的CTCs負(fù)性篩選策略的免疫熒光染色技術(shù)，檢測食管鱗癌患者外周血中的CTCs，并分析食管鱗癌患者CTCs數(shù)量與其病理生理學(xué)特征的關(guān)系，從而探討其檢測的臨床意義。

1材料與方法

1.1一般資料

選取我院2012年3月-2013年7月收治的46例食管鱗癌患者，其中男性36例，女性10例，年齡49～67歲，平均年齡(59.6±7.4)歲。納入標(biāo)準(zhǔn)：①術(shù)前均經(jīng)病理組織學(xué)明確診斷為食管鱗癌，且均為初治患者；②均未接受放化療或其它抗癌治療；③患者或家屬簽知情同意書。記錄患者的腫瘤位置、分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移狀態(tài)(N分期)、p-TNM分期、原發(fā)性腫瘤侵犯程度(T分期)、術(shù)前CTCs數(shù)量。

1.2方法

于術(shù)前一天采集患者清晨空腹外周靜脈血7.5 ml，室溫保存，并在24 h內(nèi)富集腫瘤細(xì)胞。將血液離心并去除上清后，加入紅細(xì)胞裂解液，翻轉(zhuǎn)孵育，離心后去上清，去除血液中的紅細(xì)胞。再次離心去上清，所得細(xì)胞與Miltenyi免疫磁珠混合、孵育，再經(jīng)特殊強(qiáng)磁場作用下的Ls柱去除白細(xì)胞，富集上皮來源的稀有細(xì)胞，用免疫熒光染色技術(shù)鑒定CTCs。經(jīng)Mitineyi磁珠富集后，患者外周血可檢出CK8/18/19角蛋白抗原陽性、CD45白細(xì)胞表面抗原陰性的上皮來源細(xì)胞，同時(shí)，可見CK8/18/19陰性/CD45陽性的白細(xì)胞。本研究以CTCs數(shù)量<3為檢出陰性，CTCs數(shù)量≥3為檢出陽性[3]。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)軟件建立數(shù)據(jù)庫分析數(shù)據(jù)，計(jì)數(shù)資料采用χ2檢驗(yàn)，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2結(jié)果

2.1CTCs檢出率

本組患者外周血經(jīng)上述方法負(fù)性富集后，CTCs檢出率為65.2%(30/46)，中位數(shù)為2，檢出范圍為0～70個(gè)。

2.2術(shù)前外周血CTCs的陽性水平與臨床各病理生理參數(shù)的相關(guān)性

術(shù)前外周血CTCs的檢出陽性水平與腫瘤細(xì)胞分化程度、N分期、p-TNM分期、T分期顯著相關(guān)(P<0.05)；與患者的年齡、腫瘤位置無密切相關(guān)性(P>0.05)，見表1。

3討論

食管癌5年生存率低的主要原因是腫瘤的轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)，而部分患者由于腫瘤分期較低，腫瘤轉(zhuǎn)移證據(jù)往往不明顯，因此采取一種有效的方法及時(shí)檢測出癌細(xì)胞的播散或轉(zhuǎn)移對(duì)患者意義重大[4]。目前常用的食管癌檢測方法有影像學(xué)檢查和腫瘤標(biāo)志物檢測。影像學(xué)檢查一般只能發(fā)現(xiàn)晚期腫瘤，因此患者用這種方法檢查出腫瘤時(shí)，往往已經(jīng)失去了早期治療的機(jī)會(huì)。腫瘤標(biāo)志物檢測如檢測血液中的mRNA標(biāo)志物、循環(huán)DNA標(biāo)志物等，這種方法有助于早期發(fā)現(xiàn)腫瘤，其缺點(diǎn)是特異性較差，易出現(xiàn)假陽性結(jié)果[5]。CTCs是腫瘤轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)的首要條件，基于核酸的PCR技術(shù)能檢測到食管癌患者外周血中的CTCs，但該方法易得到假陽性結(jié)果、無法觀察到單個(gè)CTC細(xì)胞形態(tài)、無法估算樣本中腫瘤細(xì)胞的數(shù)量，因此效果不佳。與PCR技術(shù)相比，近些年來基于細(xì)胞學(xué)的免疫富集方法，既可分離、計(jì)數(shù)腫瘤細(xì)胞，又可在細(xì)胞水平上進(jìn)一步分析細(xì)胞的分子表型，是一種較理想的CTCs檢測方法[6]。

表1　術(shù)前外周血CTCs檢出陽性水平與臨床各

本研究采用負(fù)性富集篩選策略的免疫熒光染色法，檢測食管鱗癌患者外周血中的CTCs，結(jié)果顯示這種方法分離、富集、鑒定CTCs的效果較理想，CTCs檢出率為65.2%，與其它上皮來源的實(shí)體瘤CTCs檢出率報(bào)道相近[7-9]。有研究表明食管癌患者外周血CTCs術(shù)前檢出水平與腫瘤細(xì)胞的分化程度、N分期、p-TNM分期、T分期顯著相關(guān)。本研究結(jié)果亦表明腫瘤細(xì)胞分化程度越低、N分期越高、T分期越高、p-TNM分期，外周血CTCs檢出數(shù)量越高[10]。其中腫瘤細(xì)胞分化程度及p-TNM分期與CTCs檢出水平的相關(guān)性，提示CTCs的檢出數(shù)量可作為食管鱗癌惡化程度的指標(biāo)，反映腫瘤的進(jìn)展程度，有助于及早發(fā)現(xiàn)腫瘤、正確判斷腫瘤的進(jìn)展情況，使患者得到及時(shí)有效的治療，延長生存期，改善患者的生命質(zhì)量，并為治療效果及預(yù)后提供重要參考。

總之，采用負(fù)性富集篩選策略檢測食管鱗癌治療后外周血CTCs有助于食管鱗癌的診斷、并能反映腫瘤的進(jìn)展程度、評(píng)估療效、指導(dǎo)治療及判斷預(yù)后。

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(編輯：甘艷)

Detection of Circulating Tumor Cells in Peripheral Blood of Patients with Esophageal Squamous Cell Carcinoma and Its Clinical Significance

YUANDonghong，WANGFang，CHENXuemei.Yan’anUniversityAffiliatedHospital，Yan’an，716000

【Abstract】ObjectiveTo explore the number of circulating tumorceus(CTCs)in the peripheral blood of patients with esophageal squamous cell carcinoma(ESCC)，and its relationship with physiopathological characteristics of esophageal neoplasms.MethodsUsing negatives selection system，red blood cells(RBCs)and white blood cells(WBCs)were depleted by red blood cell lysis buffer(RCLB)and Mihenyi magnetic beads，and the rare cells were enriched.Immunofluorenee staining(IF)was adopted to identify CTCs.Relationship between positive level of CTCs in the peripheral blood of patients with ESCC before surgery and physiopathological characteristics were analyzed.ResultsPositive level of CTCs in the peripheral blood of patients with ESCC was closely related to cell differentiation grade，lymph node metastasis status(N staging)，P-TNM stages，and invasion of primary cancer(T staging)(P<0.05)；and it was not related to age and location of tumor(P>0.05).ConclusionThe number of CTCs in the peripheral blood of patients with ESCC shows the tumor biology degree of deterioration，and it maybe served as a tumor marker to evaluate the treatment and prognosis of esophageal cancer.

【Key words】Esophageal squamous cell carcinoma(ESCC)；Cimulating tumor cells(CTCs)；Negative selection

(收稿日期2014-08-13修回日期 2014-12-02)

中圖分類號(hào)：R735.1

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

文章編號(hào)：1001-5930(2015)04-0494-03

DOI：10.3969/j.issn.1001-5930.2015.04.007

通訊作者：袁東紅