吳巍蕓　周　宇

作者單位：524001 廣東醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院消化內(nèi)科

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miR-20b對(duì)大腸癌細(xì)胞增殖和凋亡的影響及其機(jī)制的研究

吳巍蕓周宇

作者單位：524001 廣東醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院消化內(nèi)科

【摘要】目的探討miR-20b對(duì)大腸癌(CRC)細(xì)胞增殖凋亡的影響及機(jī)制。方法將miR-20b模擬物轉(zhuǎn)染CRC細(xì)胞株HCT-116，qRT-PCR檢測(cè)轉(zhuǎn)染后miR-20b的表達(dá)，分別應(yīng)用CCK-8實(shí)驗(yàn)及流式細(xì)胞儀檢測(cè)轉(zhuǎn)染后細(xì)胞增殖和凋亡情況。qRT-PCR和western blot檢測(cè)轉(zhuǎn)染后Bcl-w mRNA和蛋白的表達(dá)情況。結(jié)果轉(zhuǎn)染miR-20b 模擬物后，HCT-116細(xì)胞中miR-20b表達(dá)水平明顯上調(diào)，HCT-116細(xì)胞增殖減弱(P<0.05)，凋亡增強(qiáng)(P<0.05)。miR-20b可作用于Bcl-w mRNA 的3′-UTR，使海腎熒光素酶活性顯著降低。轉(zhuǎn)染后Bcl-w mRNA及蛋白表達(dá)水平明顯下調(diào)，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。結(jié)論上調(diào)HCT-116細(xì)胞中miR-20b表達(dá)水平，可抑制其靶基因Bcl-w的表達(dá)，發(fā)揮抑制細(xì)胞增殖、增加凋亡的作用。

【關(guān)鍵詞】微小RNA；大腸癌；Bcl-w；增殖；凋亡

(ThePracticalJournalofCancer，2015，30:0020～0024)

大腸癌(colorectal cancer，CRC)的發(fā)生、發(fā)展是多因素參與的過(guò)程。原癌基因和抑癌基因的異常表達(dá)及其編碼蛋白功能的改變可影響腫瘤發(fā)生的多個(gè)方面，包括細(xì)胞的增殖、侵襲、轉(zhuǎn)移、血管生成、耐藥以及維持遺傳基因穩(wěn)定等[1]。微小RNA (microRNA，miRNA，miR)是一類非編碼單鏈小分子RNA，其與靶基因mRNA的3'非編碼末端(3'-UTR)完全和部分互補(bǔ)性結(jié)合，從而引起靶mRNA的降解或者阻遏其轉(zhuǎn)錄后翻譯，與腫瘤[2]、心血管疾病[3]、炎癥[4]等病理生理過(guò)程相關(guān)。多個(gè)研究發(fā)現(xiàn)，與正常大腸組織相比，CRC存在多種miRNA表達(dá)異常[5-7]。其中基因芯片檢測(cè)顯示miR-20b在CRC組織中表達(dá)明顯下調(diào)[5]，本實(shí)驗(yàn)通過(guò)分析miR-20b對(duì)CRC細(xì)胞的增殖、凋亡的影響及對(duì)其潛在靶基因Bcl-w的調(diào)控，探討miR-20b在CRC發(fā)生發(fā)展中的作用。

1材料與方法

1.1主要材料及試劑

人大腸癌細(xì)胞株HCT-116購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院典型培養(yǎng)物保藏委員會(huì)細(xì)胞庫(kù)。轉(zhuǎn)染試劑lipofectamineTM2000(lipo2000)購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司，Opti-MEM I培養(yǎng)基、RPMI1640培養(yǎng)基、胎牛血清購(gòu)自美國(guó)Gibco公司。人miR-20b 模擬物(mimics)、miRNA-20b mimics陰性對(duì)照(miR-20b mimics-NC)購(gòu)自廣州銳博生物科技有限公司。CCK-8試劑盒購(gòu)自上海Dojindo公司。Annexin V-FITC細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒、小鼠抗人β-actin抗體、辣根過(guò)氧化物酶(HRP)標(biāo)記的羊抗兔或羊抗小鼠IgG、超敏ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒購(gòu)自碧云天生物技術(shù)有限公司。兔抗人Bcl-w抗體購(gòu)自美國(guó)Santa Cruz公司。 RNAiso Plus、One Step PrimeScript(R)miRNA cDNA Synthesis Kit、PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser(Perfect Real Time)、SYBR(R)Premix Ex TaqTMⅡ (Tli RNaseH Plus)均購(gòu)自大連Takara公司。TIANGEN高純度質(zhì)粒小提中量試劑盒購(gòu)自天根生化科技有限公司。雙熒光素酶報(bào)告系統(tǒng)檢測(cè)試劑盒購(gòu)自Promega公司。miR-20b、U6、Bcl-w、β-actin引物由上海生工生物工程公司合成。

1.2細(xì)胞培養(yǎng)和轉(zhuǎn)染

HCT-116細(xì)胞用含10%胎牛血清，100 U/mL青霉素和100 μg/mL鏈霉素的RPMI 1640培養(yǎng)液，置于37 ℃、含5% CO2的培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)。將HCT-116細(xì)胞接種至6孔板，繼續(xù)培養(yǎng)24 h待細(xì)胞長(zhǎng)至60%左右融合時(shí)轉(zhuǎn)染。實(shí)驗(yàn)分為2組：①miR-20b mimics轉(zhuǎn)染組：使用lipo2000將miR-20b mimics(終濃度100 nmol/L)轉(zhuǎn)染入細(xì)胞；②NC組：使用lipo2000將miR-20b mimics-NC(終濃度100 nmol/L)轉(zhuǎn)染入細(xì)胞。

1.3實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR(qRT-PCR)檢測(cè)轉(zhuǎn)染后miR-20b的表達(dá)

各組細(xì)胞轉(zhuǎn)染48 h后，用RNAiso Plus提取總RNA。PrimeScript(R)miRNA cDNA Synthesis Kit試劑盒進(jìn)行miRNA逆轉(zhuǎn)錄。所得cDNA再使用試劑盒進(jìn)行PCR反應(yīng)。miR-20b以U6作為內(nèi)參。反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性30 s，95℃變性5 s，60℃退火延伸20 s，擴(kuò)增40個(gè)循環(huán)。qRT-PCR引物序列如下：miR-20b 上游引物，5′-CAAAGTGCTCATAGTGCAGGTAG-3′；U6上游引物，5′-CTCGCTTCGGCAGCACA-3′；miRNA下游引物Uni-miR、qPCR、Primer包含在逆轉(zhuǎn)錄試劑盒中。每個(gè)反應(yīng)設(shè)3個(gè)復(fù)孔，miR-20b的相對(duì)表達(dá)量用2-△Ct法計(jì)算。

1.4CCK-8法檢測(cè)miR-20b mimics轉(zhuǎn)染后細(xì)胞增殖情況

將HCT-116細(xì)胞接種于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板，按上述分組轉(zhuǎn)染，分別培養(yǎng)24 h、48 h、72 h、96 h后，每孔更換新鮮培養(yǎng)基200 μl，再加20 μL CCK-8溶液。培養(yǎng)板在培養(yǎng)箱內(nèi)孵育2 h。用酶標(biāo)儀測(cè)定在450 nm處的吸光度。記錄結(jié)果，以時(shí)間為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)繪制細(xì)胞生長(zhǎng)曲線。

1.5流式細(xì)胞儀檢測(cè)miR-20b mimics轉(zhuǎn)染后細(xì)胞凋亡情況

HCT-116細(xì)胞接種于12孔細(xì)胞培養(yǎng)板，按上述分組轉(zhuǎn)染，繼續(xù)培養(yǎng)72 h，胰酶消化、收集細(xì)胞，PBS洗滌1次，離心后加入Annexin V-FITC室溫避光孵育10 min。離心后棄上清，加入碘化丙啶(PI)染色液，冰浴避光放置30 min。進(jìn)行流式細(xì)胞儀檢測(cè)。

1.6雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)

通過(guò)TargetScan Human 6.2(http：//www.targetscan.org/)、microRNA.org(http：//www.microrna.org)等常用的生物信息學(xué)網(wǎng)站，預(yù)測(cè)miR-20b的潛在靶基因及其結(jié)合位點(diǎn)。PCR擴(kuò)增包含miR-20b結(jié)合位點(diǎn)在內(nèi)的Bcl-w 3′-UTR序列。將目的序列與雙熒光素酶報(bào)告基因載體連接后的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化入DH5α感受態(tài)細(xì)胞中，擴(kuò)增，應(yīng)用TIANGEN高純度質(zhì)粒小提中量試劑盒提取質(zhì)粒。將含預(yù)測(cè)結(jié)合位點(diǎn)的Bcl-w 3′-UTR序列的質(zhì)粒命名為pmiR-Bcl-w-wt，含Bcl-w 3′-UTR突變序列的質(zhì)粒命名為pmiR-Bcl-w-mut。將pmiR-Bcl-w-wt或pmiR-Bcl-w-mut分別與miR-20b mimics或miR-20b mimics-NC共轉(zhuǎn)染HCT-116細(xì)胞。培養(yǎng)48 h后，檢測(cè)各組海腎及螢火蟲(chóng)熒光素酶活性，兩者比值進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。

1.7qRT-PCR檢測(cè)miR-20b mimics轉(zhuǎn)染后Bcl-w mRNA的表達(dá)

各組細(xì)胞轉(zhuǎn)染48 h后，用RNAiso Plus提取總RNA。使用PrimeScript(R)RT reagent Kit with gDNA Eraser(Perfect Real Time)試劑盒進(jìn)行mRNA逆轉(zhuǎn)錄。反應(yīng)所得的cDNA再使用SYBR(R)Premix Ex TaqTMⅡ (Tli RNaseH Plus)試劑盒進(jìn)行PCR反應(yīng)。以β-actin作為內(nèi)參。反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性30 s，95℃變性5 s，60℃退火延伸20 s，擴(kuò)增40個(gè)循環(huán)。引物序列如下：Bcl-w上游引物，5′-TTCACCCTACCCTCTACCA-3′；Bcl-w下游引物，5'-AGCCCTTTACCCTTTCAG-3'；β-actin上游引物，5′-GGCGGCA-ACACCATGTACCCT-3′；β-actin下游引物，5′-AGGGGCCGGACTCGTCATACT-3′。

1.8Western blot檢測(cè)miR-20b mimics轉(zhuǎn)染后Bcl-w蛋白的表達(dá)

用細(xì)胞裂解液裂解細(xì)胞并提取細(xì)胞總蛋白，BCA法進(jìn)行蛋白定量后，SDS-PAGE電泳分離總蛋白，電轉(zhuǎn)移到PVDF膜上，5%脫脂牛奶封閉1 h后，抗Bcl-w抗體(1∶800)及抗β-actin抗體(1∶1000)4℃孵育過(guò)夜。TBST洗膜后，加入HRP標(biāo)記的羊抗兔或羊抗小鼠二抗(1∶1000)室溫孵育1 h，用ECL發(fā)光液顯影，X光壓片曝光。應(yīng)用Quantity One軟件對(duì)條帶進(jìn)行分析。

1.9統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

應(yīng)用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。數(shù)據(jù)以均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，三組間比較采用單因素方差分析，兩組間比較采用兩個(gè)獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)。

2結(jié)果

2.1miR-20b mimics轉(zhuǎn)染后細(xì)胞miR-20b表達(dá)上調(diào)

qRT-PCR結(jié)果顯示，與miR-20b mimics-NC轉(zhuǎn)染組比較，miR-20b mimics轉(zhuǎn)染組miR-20b表達(dá)水平明顯上調(diào)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)(圖1)。

圖1　CRC細(xì)胞轉(zhuǎn)染后各組miR-20b的表達(dá)情況

2.2過(guò)表達(dá)miR-20b抑制HCT-116細(xì)胞增殖

轉(zhuǎn)染miR-20b mimics至HCT-116細(xì)胞，分別培養(yǎng)24 h、48 h、72 h、96 h后，CCK-8檢測(cè)細(xì)胞增殖情況。由圖2可見(jiàn)，培養(yǎng)48 h、72 h、96 h時(shí)，miR-20b mimics轉(zhuǎn)染組在450 nm處的吸光度較相應(yīng)的NC組明顯下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

圖2　CCK-8法檢測(cè)兩組細(xì)胞增殖情況

2.3過(guò)表達(dá)miR-20b促進(jìn)HCT-116細(xì)胞凋亡

轉(zhuǎn)染miR-20b mimics至HCT-116細(xì)胞，培養(yǎng)72 h后應(yīng)用流式細(xì)胞儀檢測(cè)。miR-20b mimics轉(zhuǎn)染組Annexin V-FITC單陽(yáng)性細(xì)胞較NC組明顯增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)(圖3)。

2.4雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)

在轉(zhuǎn)染pmiR-Bcl-w-wt質(zhì)粒的實(shí)驗(yàn)中，miR-20b mimics組與NC組相比較，海腎/螢火蟲(chóng)熒光素酶活性下降，兩組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。在轉(zhuǎn)染pmiR-Bcl-w-mut質(zhì)粒的實(shí)驗(yàn)中，miR-20b mimics組與NC組相比較，海腎/螢火蟲(chóng)熒光素酶活性無(wú)明顯變化(P>0.05)(圖4)。

2.5miR-20b mimics轉(zhuǎn)染后HCT-116細(xì)胞中Bcl-w表達(dá)水平下調(diào)

qRT-PCR檢測(cè)結(jié)果顯示，與轉(zhuǎn)染miR-20b mimics-NC組比較，miR-20b mimics轉(zhuǎn)染組細(xì)胞Bcl-w mRNA的表達(dá)水平明顯下調(diào)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)(圖5A)。Western blot檢測(cè)結(jié)果顯示，與轉(zhuǎn)染miR-20b mimics-NC組比較，miR-20b mimics轉(zhuǎn)染組細(xì)胞Bcl-w蛋白的表達(dá)水平明顯下調(diào)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)(圖5B和5C)。

3討論

miRNA是近年來(lái)發(fā)現(xiàn)的一類具有重要調(diào)控作用的非編碼小分子RNA。研究發(fā)現(xiàn)，多種人類腫瘤，包括CRC，都伴有miRNA的表達(dá)異常。miRNA通過(guò)靶基因的調(diào)控，對(duì)腫瘤細(xì)胞生物學(xué)行為產(chǎn)生影響，在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展過(guò)程起作用。Yu等[8]發(fā)現(xiàn)，miR-208在人CRC組織中較正常組織表達(dá)下降，并與TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、腫瘤分化程度相關(guān)，表達(dá)低的患者比表達(dá)高的患者生存時(shí)間更短，說(shuō)明在大腸癌中miRNA的異常表達(dá)與腫瘤的特性和患者的預(yù)后相關(guān)。miR-154在CRC組織和細(xì)胞系中表達(dá)降低，過(guò)表達(dá)miR-154通過(guò)作用于其靶基因toll樣受體2(TLR2)，抑制CRC細(xì)胞增殖、克隆形成、侵襲、轉(zhuǎn)移等，發(fā)揮抑癌作用[9]。miR-20b與腫瘤的關(guān)系也有少量研究。有研究發(fā)現(xiàn)，miR-20b在缺氧的微環(huán)境下可以降低乳腺癌細(xì)胞的血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子表達(dá)[10]?；蛐酒Y(jié)果也顯示，miR-20b在CRC組織較正常大腸組織表達(dá)下調(diào)[5]，但miR-20b如何影響大腸癌的發(fā)生、發(fā)展呢？本研究發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)染miR-20b mimics至HCT-116細(xì)胞后，大腸癌細(xì)胞HCT-116的miR-20b表達(dá)上調(diào)，同時(shí)細(xì)胞增殖明顯受抑，而細(xì)胞凋亡率增高，提示miR-20b與CRC細(xì)胞的增殖密切相關(guān)。

圖3　兩組細(xì)胞凋亡圖

以NC組為1，mimics組表示為NC組的倍數(shù)。

Bcl-w是 Bcl-2家族抗凋亡成員之一，過(guò)表達(dá)Bcl-w使細(xì)胞凋亡減少。Bcl-w與CRC形成和進(jìn)展密切相關(guān)[11]。在CRC組織中，Bcl-w表達(dá)率顯著升高，且與TNM分期和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)，提示Bcl-w與CRC的進(jìn)展有關(guān)[12]。張雋等[13]也發(fā)現(xiàn)，Bcl-w在大腸腺瘤組織中不表達(dá)，而在CRC表達(dá)明顯增高，且隨腫瘤浸潤(rùn)深度增加和淋巴轉(zhuǎn)移和肝轉(zhuǎn)移的發(fā)生，Bcl-w表達(dá)亦增加，同時(shí)Bcl-w表達(dá)陽(yáng)性CRC患者預(yù)后差，也支持上述Bcl-w與CRC的進(jìn)展有關(guān)的觀點(diǎn)。我們通過(guò)生物信息學(xué)預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn)Bcl-w是miR-20b潛在的靶基因之一，并進(jìn)一步通過(guò)雙熒光素酶報(bào)告基因證實(shí)miR-20b能與Bcl-w的3′-UTR結(jié)合。轉(zhuǎn)染miR-20b mimics后，Bcl-w mRNA和蛋白的表達(dá)水平均下調(diào)，與對(duì)照組比較，差異有顯著性，說(shuō)明在CRC細(xì)胞中，miR-20b通過(guò)與Bcl-w的3'-UTR結(jié)合，調(diào)控Bcl-w的表達(dá)，進(jìn)而影響細(xì)胞的增殖和凋亡。

綜上所述，miR-20b在CRC的發(fā)生發(fā)展中起一定作用，為CRC預(yù)防及治療提供新的靶標(biāo)。但是miRNA的調(diào)控機(jī)制復(fù)雜，一個(gè)miRNA不止一個(gè)靶基因，因此miR-20b在CRC的功能仍有廣闊的研究前景。

A為兩組Bcl-w mRNA表達(dá)情況，B為兩組Bcl-w蛋白表達(dá)情況，C為Western blot檢測(cè)兩組Bcl-w蛋白表達(dá)情況。

圖5miR-20b對(duì)HCT-116細(xì)胞Bcl-w表達(dá)的影響

參考文獻(xiàn)

[1]Harris TJ，McCormick F.The molecular pathology of cancer〔J〕.Nat Rev Clin Oncol，2010，7(5)：251-265.

[2]Kristen MN，Glen JW.MicroRNAs and cancer：past，present，and potential future〔J〕.Mol Cancer Ther，2008，7(12)：3655-3660.

[3]Divakaran V，Mann DL.The emerging role of microRNAs in cardiac remodeling and heart failure〔J〕.Circ Res，2008，103(10)：1072-1083.

[4]Abou-Zeid A，Saad M，Soliman E.MicroRNA 146a expression in rheumatoid arthritis：association with tumor necrosis factor-alpha and disease activity〔J〕.Genet Test Mol Biomarkers，2011，15(11)：807-812.

[5]Sarver AL，F(xiàn)rench AJ，Borralho PM，et al.Human colon cancer profiles show differential microRNA expression depending on mismatch repair status and are characteristic of undifferentiated proliferative states〔J〕.BMC Cancer，2009，9：401

[6]Wu WK，Law PT，Lee CW，et al.MicroRNA in colorectal cancer：from benchtop to bedside〔J〕.Carcinogenesis，2011，32(3)：247-253.

[7]Bandrés E，Cubedo E，Agirre X，et al.Identification by Real-time PCR of 13 mature microRNAs differentially expressed in colorectal cancer and non-tumoral tissues〔J〕.Mol Cancer，2006，5：29.

[8]Yu H，Gao G，Jiang L，et al.Decreased expression of miR-218 is associated with poor prognosis in patients with colorectal cancer〔J〕.Int J Clin Exp Pathol，2013，6(12)：2904-2911.

[9]Xin C，Zhang H，Liu Z.miR-154 suppresses colorectal cancer cell growth and motility by targeting TLR2〔J〕.Mol Cell Biochem，2014，387(1-2)：271-277.

[10]Cascio S，D'Andrea A，F(xiàn)erla R，et al.miR-20b modulates VEGF expression by targeting HIF-1 alpha and STAT3 in MCF-7 breast cancer cells〔J〕.J Cell Physiol，2010，224(1)：242-249.

[11]Kitamura S，Kondo S，Shinomura Y，et al.Met/HGF receptor modulates bcl-w expression and inhibits apoptosis in human colorectal cancers〔J〕.Br J Cancer，2000，83(5)：668-673.

[12]Wilson JW，Nostro MC，Balzi M，et al.Bcl-w expression in colorectal adenocarcinoma〔J〕.Br J Cancer，2000，82(1)：178-185.

[13]張雋，喬岐祿，趙建勛，等.Bcl-w在大腸癌中的表達(dá)及臨床意義〔J〕.中國(guó)現(xiàn)代醫(yī)學(xué)雜志，2007，17(12)：1413-1417.

(編輯：吳小紅)

Effect of MiR-20b on Proliferation and Apoptosis of Colorectal Cancer Cells and Its Mechanism

WUWeiyun，ZHOUYu.DepartmentofGastroenterology，AffiliatedHospitalofGuangdongMedicalCollege，Zhanjiang，524001

【Abstract】Objective To explore the effect and mechanism of on proliferation and apoptosis of colorectal cancer cells.MethodsAfter transfection of miR-20b mimics into HCT-116 cells，the expression of miR-20b was evaluated by real-time quantitative reverse transcriptase-polymerase chain reaction (qRT-PCR)，and effect of miR-20b on cell proliferation and apoptosis was determined by CCK-8 assay and flow cytometry，respectively.Bcl-w mRNA and protein was measured by qRT-PCR and western blot.ResultsMiR-20b mimics transfection significantly increased miR-20b expression in HCT-116 cells，inhibited cells proliferation and increased cells apoptosis (P<0.05).MiR-20b could effect on 3′-untranslated region (3′-UTR) of Bcl-w mRNA and decrease renilla luciferase activity.MiR-20b mimics significantly suppressed Bcl-w mRNA and protein level in CRC cells (P<0.05).ConclusionOverexpression of miR-20b in HCT-116 cells may suppress cells proliferation and increase cells apoptosis，probably by downregulating its target gene Bcl-w expression.

【Key words】MicroRNA；Colorectal cancer；Bcl-w；Proliferation；Apoptosis

(收稿日期2014-04-29修回日期 2014-09-30)

中圖分類號(hào)：R735.3+4

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

文章編號(hào)：1001-5930(2015)01-0020-05

DOI：10.3969/j.issn.1001-5930.2015.01.006

通訊作者：周宇